SANTOS, Enrico Jardim Clemente [1]
SANTOS, Enrico Jardim Clemente. Análise Tecnológica do Processo de Marcação de Células Progenitoras Multipotentes Adultas Com Nanopartículas Superparamagnéticas Visando sua Utilização na Área de Terapia Celular. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Edição 02. Ano 02, Vol. 01. pp 547-554, Abril de 2017. ISSN:2448-0959
RESUMO
As células progenitoras adultas multipotentes (CPAMs), também denominadas de células tronco mesenquimais na literatura, são células que se encontram em diversos órgãos e tecidos de organismo em um ambiente propício chamado o nicho de CPAMs. Neste, as células se mantém em estágio não diferenciado em regime da espera (stand by). Durante a nossa vida CPAMs garantem a renovação constante das células saudáveis (exp.: escamação da pele ou produção de sangue). Quando ocorre um trauma, injuria ou doença, os nichos das CPAMs são ativados pelo organismo para reparar o tecido ou atuar no organismo como um todo (exp.: doenças degenerativas, leucemias etc). Quando o trauma, injuria ou a doença é muito abrangente e o organismo não consegue produzir um número de CPAMs intrínsecas suficiente para a sua reparação, as CPAMs extrínsecas, que foram obtidas do mesmo paciente ou de um doador e guardadas nos bancos das CPAMs, podem ser utilizadas. Porém, apesar da terapia com células tronco estar revolucionando a área da medicina, a reconstrução de um tecido usando CPAMs ainda é um desafio. A marcação de células tronco e monitoramento in vivo com técnicas não invasivas de imagem se mostra necessária para a área assim como a perspectiva de aumento do enxerto celular. Vários agentes de contraste e construções com o gene repórter têm sido utilizados para marcar as células de forma que elas possam ser rastreadas através de métodos ópticos ou fluorescentes de imagem incluindo, também, a imagem por ressonância magnética (IRM). Técnicas de endocitose de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (NSOFs) pelas células têm sido desenvolvidas, incluindo uma simples marcação que se baseia em interação eletrostática das CPAMs animais e humanas com as NSOFs. Tal fato tem por objetivo contribuir para o estabelecimento de um serviço de marcação e caracterização de células tronco e demais tipos celulares.
IMAGEM POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
Imagem por ressonância magnética (IRM) celular ou molecular rapidamente se tornou um campo de pesquisa intensa. Apesar de ambas se sobreporem, a IRM molecular visualiza estruturas moleculares, proteínas, que se expressam na superfície e que podem ser indicativas para uma determinada doença. IRM celular é destinada a visualização das células por inteiro, sem a capacidade de distinguir as estruturas subcelulares e moléculas (1). Na IRM os agentes metálicos são utilizados como contrastantes podendo realçar o contraste endógeno bioorgânico (2). Porém, várias técnicas experimentais, assim como a eficiente marcação celular, baixa toxicidade das nanoparticulas (NPs), manutenção da capacidade das CPAMs se diferenciarem após a introdução de NPs, melhor via de infusão e tempo de vida ainda estão sendo aprimoradas para serem utilizadas no rastreamento das CPAMs durante a terapia (3).
O acompanhamento clínico de CPAMs por IRM ou tomografia de emissão de pósitrons (TEP) também conhecido pela sigla inglesa PET (postron emission tomography) ou tomografia computadorizada por emissão de fóton único (TCEFU) também conhecido pela sigla inglesa SPECT (single photon emission computed tomography), por exemplo, irá se tornar uma ferramenta essencial na terapia celular tanto em hospitais como em centros de pesquisa médica (4). O papel mais proeminente desta técnica será a verificação precisa da entrega de células, através de injeção guiada por IRM em associação com as NPs, fármacos e sondas terapêuticas, podendo ser guiadas ao local de ação (5,6)
NANOPARTÍCULAS
O desenvolvimento tecnológico tem permitido reduzir o tamanho dos materiais usados no campo da ciência. Ao mesmo tempo em que a redução de micropartículas para NPs oferece benefícios, também pode trazer riscos potenciais tanto para organismos como o meio ambiente (7,8). Portanto, é essencial entender o impacto de suas propriedades tais como: tamanho, forma, composição, propriedades de superfície, taxas de degradação e de remoção, que possam ter, quando em contato com modelos in vitro e in vivo (9).
As NPs magnéticas são sistemas formados por grãos da ordem de nanômetros (~ 10-9 nm) que, por encontrarem-se entre o estado molecular e o massivo, possuem propriedades físicas e químicas bastante diferentes e ajustáveis, fortemente dependentes do tamanho, morfologia e estrutura. As principais características das NPs magnéticas, responsáveis por torná-las foco de tanto interesse, são a formação de monodomínios magnéticos, a existência de grande área superficial em relação ao volume e a possibilidade de recobri-las com diversos tipos de ligantes específicos (10).
Dentre os materiais mais comumente utilizados na produção das NPs – ferro, níquel e cobalto – alguns podem ser tóxicos para as próprias células ou para o ser vivo. Análise realizadas demonstraram que os óxidos de magnetita (Fe3O4) e maghemita (γ-Fe2O3) podem ser considerados os componentes mais seguros, embora a maghemita cause menos danos às células receptoras por ter ferro em um estado oxidado (Fe3 +)( 11-13).
Estudos relacionados a biodistribuição, biocompatibilidade e toxicidade (aguda, subaguda e crônica), para um melhor conhecimento sobre os efeitos biológicos, tais como o tempo de permanência das NPs nas células e estas nos tecidos, locais de deposição das NPs no organismo, possível redistribuição, capacidades de absorção, armazenamento e excreção das NPs e interação das NPs com as células, tem sido realizados de forma a tornar esta tecnologia mais eficaz (10).
Diferentemente dos materiais massivos, que geralmente se dividem em múltiplos domínios magnéticos para diminuir a energia magneto estática, as NPs menores que um dado tamanho crítico passam a constituir um único domínio magnético. Isso acontece porque conforme as dimensões das partículas são reduzidas, os tamanhos dos domínios também diminuem, modificando a estrutura e a largura das paredes que os delimitam. Porém, abaixo de certo limite, o decréscimo na energia em função da formação de múltiplos domínios, passa a ser menor do que o aumento na energia devido à formação das paredes de domínio, tornando-se portanto, um processo não vantajoso do ponto de vista energético. Abaixo desse diâmetro crítico (DC), os monodomínios constituem a configuração mais favorável para as NPs. Para os óxidos de ferro magnetita (Fe3O4) e maghemita (γ-Fe2O3), por exemplo, monodomínios são formados em partículas de 5–20 nm de diâmetro. Além disso, com a diminuição no tamanho da partícula, uma fração cada vez maior dos átomos que a compõem localiza-se em sua superfície, tornando seu papel cada vez mais relevante. Esses átomos possuem uma vizinhança bem diferente dos átomos do interior da partícula, e assim podem afetar as propriedades físicas e magnéticas do material. Essa grande razão – área versus superfície versus volume das NPs – é uma característica vantajosa para torná-las funcionais ou para sua utilização no transporte de substâncias (10).
NANOPARTÍCULAS SUPERPARAMAGNÉTICAS DE ÓXIDO DE FERRO (NSOF)
NPs menores do que 30 nm são denominadas nanopartículas superparamagnéticos, isto é, sua magnetização ocorre apenas na presença de um campo magnético externo, sendo a NSOFs a classe dos agentes de contraste mais utilizada para marcação de células na IRM.
As NPs aprovadas pela Food and Drug Administration EUA (FDA) são agentes biodegradáveis. Uma vez que são metabolizadas pelas células acabam por entrarem no estoque de ferro do organismo. Tal fato pode ser evidenciado pela elevação da concentração de ferro no soro, um dia após a infusão e o aumento da ferritina sete dias após a administração do agente.
O Ferumoxides (Feridex, a Bayer HealthCare), que é uma NSOFs aprovada pela FDA e, 1996, foi originalmente desenvolvido como um agente de contraste para estudos hepáticas, pois após a infusão endovenosa é fagocitado e acumulado nos endossomas das células de Kupffer. Células que apresentam uma função do sistema retículoendotelial reduzida como as cancerígenas retêm a intensidade do sinal resultando em um contraste entre os tecidos normais e anormais (14,15).
A SEGURANÇA NO USO DE NSOFs
Os estudos de toxicidade de NSOFs têm sido focados sobre o seu efeito nas células de interesse tanto in vitro como in vivo (9). Após a introdução do agente de contraste nas células, suas propriedades fisiológicas devem ser preservadas: viabilidade, migração, capacidade de diferenciação, a proliferação controlada, capacidade de manter o agente de contraste para acompanhar a célula, etc. (16). Foi relatado que, quando as células tronco neurais (CTNs) continham entre 9 e 14 de ferro pg/célula, sua viabilidade e capacidade de proliferação não foram afetadas e elas se mantiveram capazes de se diferenciar em neurônios normalmente (17). Em outro estudo, as CPAMs marcadas com nanopartículas de óxido de ferro foram acompanhadas por até oito semanas, indicando uma boa duração da marcação celular (18). Estes resultados indicam que NSOFs parecem ser clinicamente seguras. Porém alguns estudos mais recentes demonstraram que cuidados devam ser tomados em relação a determinados tipos de células, tecidos e órgãos. Por exemplo, quando as CPAMs foram utilizadas em um dos experimentos, a inibição da diferenciação condrogênica destas células foi observada, apesar de a viabilidade celular e seu crescimento não terem sido afetados. Novos estudos demonstraram que NSOFs podem interferir no citoesqueleto celular desestabilizando os microfilamentos de actina. Adicionalmente, poucos estudos têm sido realizados para investigar o seu potencial tóxico sobre as células e o tecido hospedeiro (14,15).
CÉLULAS A SEREM UTILIZADAS NA IRM
Tipos celulares distintos, células tronco embrionárias (CTEs), células tronco hematopoiéticas, CPAMs, CTNs, oligodendrócitos, células de Schwann, monócitos, linfócitos, microglia, dentre outros, já foram utilizados para a marcação com NSOFs e utilizados na IMR (5). Embora a marcação das células não parecesse ser muito difícil, o controle da quantidade do agente de contraste é geralmente mal estudado e não estando bem determinado. De fato, é bastante difícil de se avaliar precisamente a quantidade de marcadores que foram incorporados por uma única célula. No delineamento experimental da marcação de células, a heterogeneidade entre as células também deve ser considerada (19).
As NPs foram configuradas para marcar células fagocíticas, uma vez que são rapidamente capturadas por macrófagos, monócitos, células de Kuffer, dentre outros tipos celulares (20). Entretanto, as CPAMs não são fagocíticas o que torna sua marcação celular com NPs pouco eficaz. Tal fato se deve às NSOFs serem altamente negativas de forma que não aderem a membrana sem que ocorra a alteração de cargas em sua superfície. Sendo assim, torna-se necessário o estabelecimento de protocolos específicos sem que as propriedades biológicas e terapêuticas das CPAMs sejam alteradas (21).
Dentre as metodologias mais empregadas para que a endocitose ocorra é a combinação das NSOFs com agentes de transfecção policatiônicos como a poli-L-lisina, a lipofectamina e o sulfato de protamina. Estes conferem carga positiva à superfície das NSOFs elevando a interação eletrostática com os íons carregados negativamente presentes na superfície celular, propiciando sua aderência à membrana. No entanto, existem estratégias para otimizar a aceitação de NSOFs que incluem métodos físicos (electroporação, Microinjeção e magnetofecção) e bioquímicos (conjugação de anticorpos, peptídeos ou aptâmeros)(22).
Nos últimos anos, por meio de estudos in vitro, foi possível se detectar células únicas marcadas com NSOFs na IRM, comprovando o elevado poder de resolução da técnica. Entretanto, ainda existem poucos estudos quantitativos de forma a determinar a relação entre a intensidade do sinal e o número de células marcadas, quantas células podem ser detectadas in vivo ou como a intensidade do sinal está relacionada a migração e proliferação celular.
ESTUDOS PRÉ-CLÍNICOS
Devido ao surgimento da terapia com células tronco e a necessidade de se estabelecer protocolos de alta resolução de monitoramento não-invasivo, a IRM tornou-se um método robusto, acelerando sua introdução na clínica médica. Hoje, a utilização das NSOFs na terapia celular e reparação tecidual já é uma realidade uma vez que nos permite realizar o rastreamento dinâmico das células marcadas após sua infusão no organismo receptor (5,6,14,15,19).
Os primeiros estudos pré-clínicos utilizando IMR para o rastreamento de células, foram realizados no início dos anos 1990. Ao longo dos anos, várias análises foram efetuadas objetivando, principalmente, a utilização de células marcadas com NSOFs na imunologia e imunoterapia. A importância da IRM aumentou drasticamente quando os primeiros resultados de estudos pré-clínicos mostraram uma prova do conceito de migração e enxertia da CPAMs em diferentes órgãos e tecidos
Estudos demonstraram que a viabilidade, o potencial de diferenciação, a taxa de proliferação e apoptose não foram afetados pela incorporação das NSOFs, quando comparadas as células não marcadas (23). Dados, obtidos por meio da IRM, comprovaram que as células mantêm-se marcadas por mais de sete semanas, demonstrando que podem ser acompanhadas durante longos períodos (18). Entretanto, a concentração de NSOFs no meio de cultura precisa ser otimizada para cada cultura de células, uma vez que a concentração mais baixa pode resultar em absorção celular insuficiente, ao passo que uma maior concentração pode induzir a precipitação de complexos, ou podem ser tóxicas para as células.
Para monitorar células in vivo, várias técnicas têm sido descritas utilizando nanopartículas (quantum dots, seixos e NSOFs), mas apenas NSOFs nanopartículas visualizadas pela IRM são aceitas na medicina humana. A IRM, como um método não invasivo, pode então ser usada não só para avaliar se as células foram enxertadas com sucesso, mas também acompanhar a evolução temporal da migração de células e da sua sobrevivência no tecido alvo. Esta informação pode ajudar no aperfeiçoamento do processo de transplante em termos do número de células necessárias, método, local de administração da célula e na janela de tempo terapêutico após a lesão, durante o qual o transplante será mais eficaz.
CONCLUSÃO
Estudos realizados no campo das NPs tem como objetivo contribuir para o desenvolvimento tecnológico permitindo o estabelecimento de um serviço de marcação e caracterização das COAMs e demais tipos celulares. A utilização de agentes de contraste de imagem permite avaliar e acompanhar o enxerto de células, de forma não-invasiva, em estudos pré-clínicos e na prática clínica. Desta forma, à baixa citotoxicidade das NSOFs, alta resolução anatômica da IRM, potencial de quantificação e aos promissores estudos em andamento, o monitoramento das CPAMs por meio da IRM irá se tornar uma importante ferramenta para a prática clínica e laboratorial.
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[1] Biocientista. Mestre, Doutor, Pós-Doutor.
