ASSIS, Tatiana Lembo Silveira de [1], WINCK, Caroline Pinho [2], SANTOS, Enrico Jardim Clemente [3]
ASSIS, Tatiana Lembo Silveira de; WINCK, Caroline Pinho; SANTOS, Enrico Jardim Clemente. Análise da Viabilidade Terapêutica das Células-Tronco Mesenquimais Alogênicas no Tratamento de Felino Acometido por Complexo Gengivite Estomatite Felina. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano 02, Vol. 01. pp 470-482, Abril de 2017. ISSN:2448-0959
RESUMO
A gengivo-estomatite crónica felina (GECF) é uma doença clinicamente complexa, severa e que apresenta lesões de caráter crônico com frequentes reagudizações e refractabilidade aos tratamentos disponíveis. Atualmente existem diferentes abordagens terapêuticas, podendo ser médica, cirúrgica ou combinação de ambas. Entretanto, as respostas ao tratamento apresentam muitas variáveis e os sucessos terapêuticos revelam-se normalmente incompletos, transitórios e de duração imprevisível, tornando-se essencial estabelecer uma estratégia terapêutica para cada animal. A utilização terapêutica das células-tronco mesenquimais(CTMs) vêm mostrando-se extremamente promissora no tratamento de diferentes doenças que acometem tanto grandes como pequenos animais. Seu potencial reparativo permite que uma vez introduzidas no organismo, adquira tanto a morfologia como a funcionalidade de qualquer tipo celular danificado que constitua o tecido lesionado. Este trabalho visa por meio das características singulares das células tronco mesenquimais alogênicas de tecido adiposo de felinos (CTMs-TAF) analisar tanto a eficácia como a viabilidade terapêutica das no tratamento do GECF.
Palavra-Chave: Terapia Celular, Patologias da Cavidade Oral, Gengivo-Estomatite Crónica Felina, Célula Tronco Mesenquimal.
INTRODUÇÃO
A GECF é uma uma inflamação oral grave, idiopática, clinicamente complexa, com frequentes reaguditzações e refractabilidade aos tratamentos disponíveis. Dentre os sinais clínicos apresentados pelos felinos temos são dor oral moderada a grave e desconforto, incluindo inapetência, redução Grooming, perda de peso e hipersalivação. A patogênese da FCGS ainda não está completamente elucidada embora acredite-se que devido ao hospedeiro, o sistema imunológico que responde de maneira inapropriada a estimulações secundárias (1).
Existem diferentes abordagens terapêuticas podendo ser médica, cirúrgica ou combinação de ambas. Entretanto, as respostas ao tratamento apresentam-se muito variáveis e os sucessos terapêuticos revelam-se normalmente incompletos e de duração imprevisível (1).
As CTMs, por definição, são células indiferenciadas com alto potencial de proliferação, auto-renovação e diferenciação em diferentes tipos celulares como, por exemplo, osteoblastos (2), condrócitos (3) e adipócitos (4). Estando presentes em todos os tecidos que constituem o animal, as CTMs são responsáveis pela manutenção da homeostase e reparação tecidual durante o transcorrer da vida do animal (5). Quando estimuladas, as CTMs liberam um grande número de moléculas bioativas que atuam modulando o sistema imune e a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual. Estudos demonstraram que as CTMs apresentam efetuso de quimiotaxia, anti-fibrótico e anti-apoptótico (6-9).
A utilização terapêutica das CTMs vêm mostrando-se extremamente promissora. Seu potencial reparativo permite que uma vez introduzidas no organismo, adquira tanto a morfologia como a funcionalidade de qualquer tipo celular danificado que constitua o tecido injuriado (6).
Este trabalho visa por meio das características singulares das CTMs analisar tanto a eficácia como a viabilidade terapêutica no tratamento do GECF.
MATERIAL E MÉTODOS
SELEÇÃO DE ANIMAIS DOADORES DE TECIDO ADIPOSO PARA TRATAMENTO ALOGÊNICO
Os animais foram selecionados a partir de populações de pacientes de clínicas veterinárias da cidade de São Paulo mediante ao consentimento livre e esclarecido por parte dos proprietários. As CTMs utilizadas no presente estudo foram obtidas a partir de animais jovens, saudáveis com até seis meses de vida (Figura 1).
ANÁLISE MOLECULAR
Foi coletada uma amostra de sangue para a análise da presença de coronavírus felino (FCoV), vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da leucemia felina (FeLV), Chlamydia psittaci (CPS), herpes vírus felino (FHV-1), Haemobartonella felis (HFE) e micoplasma através da amplificação de fragmentos dos respectivos genomas pelo método da reação em cadeia de polimerase (PCR) em materiais extraídos (RNA e DNA). Os RNAs foram extraídos com Trizol LS (Invitrogen) e utilizados para síntese de cDNA através de transcrição reversa com superscript II (Invitrogen). DNAs foram extraídos utilizando-se o DNAzol (Invitrogen). Reações positivas apresentam fragmentos de DNA de 185 pb e 410 pb (FCoV), 557 pb (FIV) 166 pb (FeLV), 167 pb (CPS), 173 pb (FHV-1), 205 pb (FCV), 170 pb (HFE) e 510 pb (micoplasma). Foram submetidas a cada pesquisa duas amostras extraídas, controles positivos e negativos.
ISOLAMENTO DAS CTMs-TAF
O tecido adiposo obtido no momento da castração foi lavado em 1x PBS de forma a retirar sangue e debris. Após a lavagem o tecido foi mantido durante 30 minutos a 370C/5% de CO2 em presença de 0,075% de colagenase tipo IV (Sigma). Foi adicionado 5 ml de meio basal sendo o sobrenadante retirado e centrifugado durante 5 minutos a 200 g. O precipitado foi ressuspenso e transferido para uma garrafa de cultivo de 25 cm2 a qual foi mantida a 370C/5% CO2 durante 48 horas em presença de meio basal quando o mesmo foi trocado. Os repiques subsequentes forma feitos por meio de ação enzimática utilizando 0.025% de tripsina (Invitrogen) (10). As células-tronco foram divididas em alíquotas de 2 x 106, ressuspensas em meio de congelamento (10% de DMSO, 70% de soro fetal bovino e 20% de meio basal contendo 2 x 106 células-tronco) e armazenadas em nitrogênio líquido. As células-tronco foram administradas com menos de 1 ano de armazenamento. Para serem aplicadas nos felinos, as células forma descongeladas em banho-maria por 2 minutos a 370C, o meio de criopreservação removido e as células transferidas para garrafa de cultivo de 25 cm2 a qual foi mantida a 370C/ 5% CO2 (Figura 1).
ANÁLISE TUMORIGÊNICA
A análise do potencial tumorigênico foi realizado por meio da introdução de 1×106 células, 4a passagem, através da via subcutânea. As CTMs-TAF foram ressuspensas em 2 ml e introduzidas subcutaneamente em três camundongos da linhagem nude. Os animais foram mantidos em ambiente estéril durante o período de sete semanas.
ANÁLISE PROLIFERATIVA
Para a análise proliferativa foi isolada uma colônia da CTM-TAF e expandida até atingir uma confluência de 70% em uma garrafa de 25 cm2. As células foram removidas enzimaticamente (tripsina 0.025%, Invitrogen) e distribuídas, em triplicatas, em garrafas de 25 cm2 na concentração de 105 células. Após três dias as células foram removidas, contadas em câmara de Neubauer e distribuídas em três novas garrafas de 25 cm2 na concentração de 1 x 105 células. O processo foi repetido até a 10a passagem (11) (Figura 1).
POTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO OSTEOGÊNICO, ADIPOGÊNICO E CONDROGÊNICO
O potencial de diferenciação osteogênico das CTM-TAF, 4a passagem, foi realizado através do cultivo em meio basal Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium–High Glucose (DMEM-HG; Invitrogen), 15% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah), 1% de antibiótico (Penicilina g 10.00u/ml; Invitrogen, Streptomicina 10.000 mg/ml; Invitrogen), 1% de l-glutamina (200mm; Invitrogen) e 1% de aminoácidos não essenciais (200mm; Invitrogen) durante o período de 24 horas na concentração inicial de 1×105 células. Após 24 h, o meio foi trocado para o de diferenciação osteogênica Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – Low Glucose (DMEM-LG; Invitrogen), 1% de 10-5M de dexametasona (Sigma), 1% 5mM de acido ascórbico (Sigma), 10% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah) e 1% Streptomicina/Penicilina (Penicilina g 10.00u/ml, Streptomicina 10.000 mg/ml; Invitrogen). A troca do meio foi feita a cada 3 ou 4 dias. No 10o dia foi adicionado 1% de 200mM de b-glicerolfosfato (Sigma) ao meio de cultura e também nas trocas subseqüentes. As células foram mantidas em cultura até o 21o dia de diferenciação. A caracterização das células foi feita por meio da coloração de Von Kossa (10) (Figura 1).
Para a análise do potencial de diferenciação adipogênico as CTM-TAF, 4a passagem, foram cultivadas em meio basal durante por 24 h na concentração inicial de 1×105 células. Após 24 horas o meio foi trocado para o de diferenciação adipogênica composto por Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium – HIGH Glucose (DMEM-HG; Invitrogen), 10% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah), 1 mM de dexametasona (Sigma), 100 mM de endomentacina (Sigma), 0,5M de isobutilmetilxantina (Sigma) + 10 µM de insulina (Sigma) e 1% de antibiótico (Penicilina g 10.00u/ml; Invitrogen, Streptomicina 10.000 mg/ml; Invitrogen), sendo a troca do meio foi feita a cada 3 ou 4 dias. As células foram mantidas em cultura até o 21o dia de diferenciação. As células foram então fixadas por 60 minutos a temperatura ambiente em presença de paraformaldéido 4%, lavadas 3 vezes com etanol 70%, mantidas a temperatura ambiente por cinco minutos com OilRed O , sendo posteriormente lavadas 3 vezes com água destilada (10)(Figura 1).
Para a análise do potencial de diferenciação condrogênico as CTM-TAF, 4a passagem, foram transferidas, na concentração 1 x 106, para tubos falcon de 15 ml, centrifugadas a 200g por 5 minutos. Em seguida foram cultivadas na presença de meio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – HIGH Glucose (DMEM-HG; Invitrogen) suplementado com 1% de soro fetal bovino (FBS; HyClone, Logan, Utah), 6,25 mM de insulina (Sigma), 0,1 mM de dexametasona (Sigma), 1 mM de piruvato de sódio (Invitrogen), 10 ng/ml TGF-β1(R&D System, LGC Biotechnology) e 1% de antibiótico (Penicilina g 10.00u/ml; Invitrogen, Streptomicina 10.000 mg/ml; Invitrogen) sendo que a troca do meio indutor foi realizada diariamente durante 21 dias. Posteriormente o pellet esférico formado foi fixado, incluso, cortado e corados com azul de toluidina (Sigma) (12) (Figura 1).
APLICAÇÃO DAS CTMs-TAF
Foi atendido um felino, macho, Himalaio/Persa, com 11 anos de idade, diagnosticado com Estomatite Ulcerativa, Neutrofílica, Linfoplasmocitaria com tecido de granulação (Complexo Gengivite Estomatite Felina). Para tal foi realizado, a partir de um fragmento tecidual da região caudal inferior interna da bochecha, o exame histopatológico (coloração com Hematoxilina e Eosina). O paciente teve o seu perfil renal e hepático, hemograma completo, raio-x de tórax e ultrassom abdominal de forma a determinar tanto o seu quadro laboratorial como minimizar a possibilidade de neoplasias. Foram aplicadas CTMs-TAF tanto pela via endovenosa como intra-gengival. Cada dose com 2 x 106 CTMs-TAF. O animal foi acompanhado quinzenalmente de forma a determinar a evolução do quadro clínico.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No presente estudo, as CTMs-TAF isoladas a partir de felinos jovens e saudáveis, foram caracterizadas com base em sua morfologia fibroblastoide, capacidade de adesão ao plástico, potencial de proliferação celular e capacidade de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica (7) (Figura 2). Quando injetadas em camundongos nude, as CTMs-TAF não foram capazes de induzir a geração de teratocarcinomas.
Na medicina veterinária as CTMs vêm sendo utilizadas e sua eficácia demonstrada em estudos relacionados à osteoartrites (13-16), lesões tendíneas (17-19), lesões na córnea (20), sequela de cinomose (21), aplasia medular (22), lesão medular (23-25) e ulceras (26,27) dentre outras. Na medicina veterinária Dentre as fontes de CTMs mais utilizadas são a medula óssea, tecido adiposo e cordão umbilical. Dentre estas, as células provenientes do tecido adiposo destacam-se por sua facilidade de obtenção e abundância, proporcionando o mínimo desconforto para o animal (28).
O animal do presente estudo apresentava um quadro de gengivite intensa, com formação de granulomas, lesões de reabsorção e secreção purulenta fétida. Não se alimentava e apresentava sialorreia intensa, tendo que ser tratado com fluidoterapia. Os exames relacionados ao perfil renal e hepático além do hemograma completo, demonstravam valores dentro da normalidade. Não foi detectada qualquer tido de formação neoplásica por meio dos exames de raios-x de tórax e ultrassom abdominal.
A análise histopatológica macroscópica revelou inúmeros fragmentos de diâmetro (maior 0,5 e 0,2 menor) e superfície lisa com coloração esbranquiçada acastanhada. Já a análise microscópica demonstrou corte na mucosa oral, com presença de área extensa de ulceração superficial, acompanhada de exsudação neutrofílica e com pequena porção de epitélio escamoso preservado, sem atipias, com presença de intensa exocitose neutrofílica. No tecido subjacente observou-se intensa proliferação fibroplásica e neovascularização (tecido de granulação), acompanhada de intenso processo inflamatório predominantemente neutrófilo, com menor quantidade de linfócitos e plasmócitos. Mais profundamente observou-se focos micronodulares de inflamação linfoplasmocitária. Em alguns dos fragmentos observou-se processo inflamatório acometendo musculatura esquelética profundamente não tendo sido detectados indícios de malignidade nas amostras avaliadas. Com base nos dados histopatológicos foi diagnosticado um quadro de estomatite ulcerativa, neutrofílica e linfoplasmocitária, intensa, associada a proliferação de tecido de granulação.
O felino foi submetido a cirurgia visando a retirada dos granulomas. Durante o procedimento foram aplicadas, após serem descongeladas, doses de CTMs-TAF tanto pela via endovenosa como intra gengival (Figura 3). Após o procedimento, foi receitado antibiótico, voltando a se alimentar normalmente 1 dias após a cirurgia. Dois meses após a cirurgia ocorreu a recidiva dos granulomas, menores, mas ainda com gengivite, lesões de reabsorção e pús. Estes dados sugerem a necessidade da aplicação de mais doses de CTMs-TAF uma vez que ocorreu uma melhora significativa após a primeira infusão.
O animal passou por consulta com especialista em odontologia, que após avaliação sugeriu extração dos dentes pré-molares e molares (lesões de reabsorção), mas deixando claro que provavelmente seria necessária a extração também dos caninos e incisivos devido a intensa gengivite.
O felino foi submetido a extração de pré-molares e molares e remoção dos granulomas sendo infundidas, após terem sido descongeladas, CTMs-TAF tanto pela via endovenosa como intra-gengival. Não foi aplicado anti-inflamatório, apenas antibiótico e analgésico no dia do procedimento. Foi prescrito como medicação pós-cirúrgica, antibiótico (Amoxicilina com Clavulanato) e Periovet para limpeza da região. O fato de não ter sido necessária a utilização anti-inflamatórios se deve, provavelmente a está característica das CTMs uma vez que, por meio de ação modulatória, regulam a produção de citocinas pró-inflamatórias (29).
As CTMs têm sido alvo de uma série pesquisas voltadas para doenças imunomediadas e doenças inflamatórias crônicas. Quando entram em contato direto com um tecido ou ainda mediante a interação parácrima, as CTMs desencadeiam a liberação de uma série de fatores solúveis que atuam no sistema imunológico com, por exemplo, em linfócitos e células dendríticas apresentadoras de antígeno (6). Os resultados por nós obtidos com infusão de CTMs-TAF após serem criopreservadas são equivalentes aos obtidos no tratamento utilizando CTMs-TAF. Autólogas (30). Ambas aboradagens se demonstraram seguras e eficazes no que tange ao tratamento do CGEF.
Foi relatado que ao chegar em casa animal se alimentou com ração seca não sendo necessário o uso de anti-inflamatório e analgésico. O felino retornou 4 meses após a cirurgia para a reavaliação. Não foi detectada recidiva do CGEF nem efeitos adversos as infusões das CTMs-TAF como vômito, náusea, alteração da pressão arterial e/ou variação na frequência respiratória (Figura 4).
CONCLUSÃO
Os resultados demonstram que a aplicação das CTMs-TAF alogênicas de felinos jovens e clinicamente saudáveis, após serem expostas ao processo de criopreservação, resultou em uma significativa melhora da qualidade de vida do animal uma vez que não foi observada a recidiva do CGEF quando realizadas múltiplas aplicações.
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[1] Médica Veterinária, Médica Veterinária na Clínica Veterinária Patas & Garras.
[2] Bióloga. Mestre. Gestora do Laboratório de Biotecnologia da CELLTROVET.
[3] Biocientista. Mestre, Doutor, Pós-Doutor. Diretor de Inovação Tecnológica da CELLTROVET.