Avaliação da Atividade Antioxidante do Extrato Hidroalcoólico da Casearia Sylvestris

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Avaliação da Atividade Antioxidante do Extrato Hidroalcoólico da Casearia Sylvestris
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CAMARGO, Bruna Almeida Furquim de [1], PRADO, Marnie Chaves Genari Brandão [2]

CAMARGO, Bruna Almeida Furquim de; PRADO, Marnie Chaves Genari Brandão. Avaliação da Atividade Antioxidante do Extrato Hidroalcoólico da Casearia Sylvestris. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano 03, Ed. 02, Vol. 01, pp. 187-200, Fevereiro de 2018. ISSN: 2448-0959

RESUMO

A Casearia sylvestris Swats, pertencente à família Salicaceae Mirb, grupos das Angiospermas é popularmente conhecida como guaçatonga. Possui ação cicatrizante, antisséptico, antitérmico, depurativo, antimicrobiano, antifúngico, anestésico tópico, antiulceroso, antirreumático, antidiarreico, anti-inflamatório, no tratamento de doenças de pele e antiofídico. Várias pesquisas com plantas medicinais vendo sendo realizadas em busca de compostos com elevada atividade antioxidante devido suas propriedades redutoras para a inibição de radicais livres. Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias capazes de retardar ou inibir a oxidação de substratos oxidáveis. Dentro deste contexto, o objetivo desta pesquisa fundamentou-se na obtenção do extrato hidroalcoólico da Casearia sylvestris, caracterização de flavonoides, avaliação do seu potencial antioxidante pelo método de Quantificação de Polifenois Totais e determinação da atividade antioxidante in vitro pela Técnica de DPPH. O extrato demonstrou a presença de flavonoides através dos ensaios cromáticos, no qual a reação de Shinoda determinou a presença de flavonóis, enquanto que a reação de Cloreto Férrico a presença de flavonóis e flavononas e a reação de Hidróxido de Sódio a presença de flavanonas. A avaliação da atividade antioxidante pela quantificação de polifenois totais apresentou 267,50 µg/mL enquanto que pela técnica de DPPH o extrato apresentou EC50 de 1.734 mg/L e 0,12g extrato/g DPPH. Os resultados descritos neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a ação antioxidante de substâncias isoladas da espécie Casearia sylvestris.

Palavras-Chave: Guaçatonga, Polifenos, DPPH.

INTRODUÇÃO

No Brasil, a utilização de plantas no tratamento de doenças apresenta fundamental influência das culturas indígena, africana e europeia (FALCÃO et al., 2017). A Organização Mundial da Saúde, desde 1997, incentiva o estudo de plantas medicinais, com o objetivo de avaliar cientificamente os benefícios da utilização de medicamentos fitoterápicos (GONÇALVES, 2007).

Casearia sylvestris Swats, pertencente à família Salicaceae Mirb, grupos das Angiospermas (AMENI, 2015) é popularmente conhecida como guaçatonga, café-bravo, café-do-diabo, cafezeiro do-mato, chá-de-bugre, erva-de-tiú ou erva-de-lagarto em função da região geográfica onde ocorre, sendo, no Brasil, distribuída em 22 estados (ARAUJO et al.,2014; MARQUETE, 2001; SASSIOTO et al., 2004).

A espécie ​C. sylvestris é citada na “Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse do SUS” (RENISUS), onde constam 71 espécies que possam atender às doenças com maior incidência no Brasil (LOPES, 2015; SILVA, 2016) e é a única espécie do gênero incluída na Farmacopeia Brasileira (SILVA, 1926). A importância em estudá-la deve-se, principalmente, pelos diversos usos na medicina popular, a qual possui ação cicatrizante, antisséptico, antitérmico, depurativo, antimicrobiano, antifúngico, anestésico tópico, antiulceroso, antirreumático, antidiarreico, anti-inflamatório, no tratamento de doenças de pele e antiofídico (FERREIRA et al., 2011; ODA, 2017).

As plantas contêm inúmeros constituintes e seus extratos podem apresentar efeitos sinérgicos entre os diferentes princípios ativos devido à presença de compostos de classes diferentes contribuindo para a mesma atividade (SILVA, 2011). A preparação de amostras vegetais possui várias etapas, sendo a primeira a mais importante, a extração, que consiste na finalidade de separar substâncias de interesse de uma matriz complexa (COSTA, 1994; BANDEIRA, 2004).

A polaridade do solvente pode influenciar na eficiência de extração, sendo assim, o solvente escolhido deve ser o mais seletivo possível, pois é devido à seletividade que se podem extrair as substâncias desejadas. Como a seletividade depende da polaridade, o grau de polaridade do grupo que se pretende extrair determina o solvente ou a mistura de solventes que mais se aproxima do ótimo de seletividade para aquela extração (POLITI, 2009). Segundo Saldanha (2005), a utilização de solventes com diferentes polaridades possibilita a extração de compostos mais polares (aquoso) ou apolares (etanólico). Portanto, a utilização de uma solução extratora hidroalcoólica é capaz de carregar tanto compostos mais polares quanto os menos polares, significando uma vantagem na extração (CHAICOUSKI et al., 2014).

Várias pesquisas com plantas medicinais vendo sendo realizadas em busca de compostos com elevada atividade antioxidante devido suas propriedades redutoras para a inibição de radicais livres, assim também, os metabólitos secundários comparando com antioxidantes sintéticos possuem baixa toxicidade e estão sendo cada vez mais investigados (POTTERAT, 1997).

Na literatura há estudos indicando a presença da atividade antioxidante da C. sylvestris. Guntzel (2008) analisou o extrato etanólico e aquoso da planta através da técnica de DPPH. O extrato etanólico também foi analisado por Espinosa (2015) através da técnica de DPPH.

Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias capazes de retardar ou inibir a oxidação de substratos oxidáveis, os polifenóis, produtos secundários do metabolismo vegetal, constituem um amplo e complexo grupo de fitoquímicos, com mais de 8000 estruturas conhecidas. Este diversificado grupo de compostos encontra-se dividido em várias classes, segundo o esqueleto carbônico dos fitoquímicos, dentre as quais se destacam a dos ácidos fenólicos e a dos flavonoides, entre outras. A capacidade antioxidante dos polifenóis é devida, principalmente, as suas propriedades redutoras, cuja intensidade da ação antioxidante exibida por estes fitoquímicos é diferenciada uma vez que depende, fundamentalmente, do número e posição de hidroxilas presentes na molécula (MELO et al., 2008; MORAIS et al., 2009)

Antioxidantes podem ser sintéticos como o butil hidroxianisol (BHA) e o butil hidroxitolueno (BHT), largamente utilizados pela indústria de alimentos, ou naturais, denominados substâncias bioativas, que incluem organosulfurados, os fenólicos (tocoferóis, flavonoides e ácidos fenólicos), os terpenos, carotenoides e o ácido ascórbico que fazem parte da constituição de diversos alimentos (OLIVEIRA et al., 2007).

Dentro deste contexto, o objetivo desta pesquisa fundamentou-se na obtenção do extrato hidroalcoólico da C. Sylvestris, caracterização de flavonoides, avaliação do seu potencial antioxidante pelo método de Quantificação de Polifenóis Totais e determinação da atividade antioxidante in vitro pela Técnica de DPPH.

MATERIAIS E MÉTODOS

Obtenção do extrato hidroalcoólico

As folhas secas da C. sylvestris Swats foram compradas em Rio Claro, SP. Em seguida, passaram pelo processo de extração por maceração em solução hidroalcóolica 70% a temperatura ambiente por 7 dias. O filtrado resultante foi evaporado sob vácuo a temperatura de 50°C até a remoção total do etanol para obtenção do extrato hidroalcóolico (EH).

Caracterização de Flavonoides

Reação de Shinoda

Em um tubo de ensaio, foi adicionado 5 mL do extrato e um pequeno fragmento de magnésio. Após, foi acrescentado 1 mL de ácido clorídrico (MOUCO, BERNARDINHO, CORNÉLIO, 2003).

Reação com Cloreto Férrico

O extrato foi diluido com água na proporção 1:5. Em dois tubos de ensaios foi colocado 5 mL do extrato diluído, sendo adicionado em um deles 1 gota de cloreto férrico a 2% (MOUCO, BERNARDINHO, CORNÉLIO, 2003).

Reação com Hidróxido de Sódio

O extrato foi diluido na proporção 1:5. Em um tubo de ensaio foi adicionado 5 mL do extrato diluido e 1 ou 2 gotas de NaOH 5% (MOUCO, BERNARDINHO, CORNÉLIO, 2003).

Avaliação da atividade antioxidante pela Quantificação de Polifenóis Totais

O teor de polifenóis foi determinado segundo método descrito por Obanda e Owor (1997), o extrato foi preparado com acetona 70%. Após, realizou-se uma diluição e transferiu-se 2mL da amostra preparada, 1 mL de solução de ácido de fosfotúngstico R (Reagente fenólico de Folin-Ciocalteau 2/N) e 10 mL de água para balão volumétrico de 25 mL, sendo completado o volume com solução de carbonato de sódio a 14,06%, deixando o sistema em repouso por 30 minutos. Realizou-se a leitura da absorbância a 700 nm utilizando a água como branco.

Para a quantificação foi empregada uma curva padrão de ácido gálico ( 05 a 50 µg/mL) e expressos como mg de EAG (Equivalente de ácido gálico) por g de extrato. Realizou-se a leitura do ácido gálico a 700 nm e utilizou-se água como branco.

Determinação da atividade antioxidante in vitro pela técnica DPPH

Foi preparado solução de álcool metílico a 50%, acetona a 70%, solução controle de álcool metílico, acetona e água e solução de DPPH a 0,06nM. A partir da solução inicial de DPPH, preparou-se soluções com variação de concentrações (10 µM a 50 µM). A partir dessas soluções realizou-se a curva de DPPH (10 µM a 50 µM), a leitura foi realizada em espectrofotômetro a 515 nm, utilizando cubetas e vidro e álcool metílico como branco.

Para a amostra, preparou-se 1g do extrato em metanol 50%, após 60 min foi centrifugado a 15.000 rpm durante 15 min. O sobrenadante foi transferido para um balão volumétrico de 100mL. A partir do resíduo da primeira extração, foi adicionado acetona 70% e após 60 min centrifugado novamente a 15.000 rpm por 15 min, transferindo o sobrenadante para o balão volumétrico contendo o primeiro e completando o volume com água destilada.

Para a determinação da atividade antioxidante total (AAT) preparou-se três diluições distintas do extrato obtido, transferiu-se 0,1mL de cada diluição para tubos de ensaios com 3,9 mL do radical DPPH 0,06nM. Utilizou 0,1mL da solução controle com 3,9 mL do radical DPPH, álcool metílico como branco e as leituras, em espectrofotômetro a 515 nm foram monitoradas a cada minuto, observando a redução da absorbância até sua estabilização. Para o cálculo do EC50 foi utilizado da absorbância final (RUFINO et al., 2007).

RESULTADOS E DISCUSSÕES

Extrato hidroalcoólico

Foi obtido um extrato com coloração castanha e odor forte característico do vegetal pesquisado, para isso utilizou a maceração, operação na qual a extração da matéria-prima vegetal é realizada em recipiente fechado, durante um período prolongado de tempo, sob agitação ocasional (VOIGT, 2000). Optou-se pela utilização dessa técnica pela sua simplicidade e custo reduzido (SIMÕES, 2007).

Utilizou-se uma solução extratora hidroalcoólica pela sua capacidade de carregar tanto compostos mais polares quanto os menos polares, significando uma vantagem na extração (CHAICOUSKI et al., 2014).

Caracterização de Flavonoides

Os ensaios cromáticos são importantes como estágio preliminar de análise, os quais são possíveis distinguir as classes de flavonoides. A coloração obtida varia conforme o núcleo, o número e a disposição dos substituintes hidroxilados (SIMÕES, 2007).

Os resultados das análises de caracterização de flavonoides encontram-se na tabela 1.

Tabela 1. Reações de Caracterização de Flavonoides

REAÇÃO ESPECIFICAÇÃO EXTRATO DE C. sylvestris
SHINODA Rósea-avermelhada – Flavonóis
Violeta – FlavanonasLaranja – Flavonas
Rósea-avermelhada
CLORETO FÉRRICO Verde-acastanhado – Flavonóis e Flavanonas
Verde – Flavonas
Verde-acastanhado
HIDRÓXIDO DE SÓDIO Amarelo intenso – Flavonóis e Flavonas
Laranja-vermelho – Flavanonas
Laranja-vermelho

 

Pode-se identificar através das reações a presença de flavonoides no extrato de C. sylvestris, o qual segundo estudos fitoquimicos constatam a presença desse composto (AMENI, 2015; SILVA, 2016).

Avaliação da atividade antioxidante pela Quantificação de Polifenóis Totais

Para determinação da quantidade de polifenóis totais no extrato de C. sylvestris, foi necessário à construção da curva de calibração apresentada na figura 1 a seguir.

Figura 1 - Curva padrão de ácido gálico no ensaio para quantificação de polifenóis totais
Figura 1 – Curva padrão de ácido gálico no ensaio para quantificação de polifenóis totais

A curva padrão do ácido gálico apresentou boa linearidade apresentando um coeficiente de determinação (R2) de 0,9981, o qual segundo Causey, Hill e Phillips (1990) deve-se apresentar um valor de pelo menos 0,99.

O indicativo de desvio padrão está representado no gráfico e a repetitividade representa a concordância entre os resultados de edições sucessivas de um mesmo método, efetuadas sob as mesmas condições de medição, chamadas condições de repetitividade: mesmo procedimento; mesmo analista; mesmo instrumento usado sob as mesmas condições; mesmo local; repetições em um curto intervalo de tempo (RIBANI et al., 2004).

O extrato hidroalcoólico de C. sylvestris apresentou uma quantidade de polifenóis totais de 267,50 µg/mL, considerado como alto teor, pois segundo segundo Rufino et al. (2010) o teor de fenóis é classificado em três categorias, menor que 10 mg EAG g¹ considerado como baixo, entre 10 e 50 EAG g como médio, e quando o teor é maior que 50 EAG g¹como alto.

Avaliação da atividade antioxidante in vitro pela técnica DPPH

A capacidade de seqüestrar radicais livres em relação ao radical estável 2,2-difenil-1-picril hidrazil (DPPH’) foi escolhida por se tratar de uma técnica simples, rápida e precisa.

Na figura 2 encontra-se a curva de calibração empregada para o experimento de DPPH.

Figura 2 - Curva padrão de DPPH com concentrações de 10µM a 50µM
Figura 2 – Curva padrão de DPPH com concentrações de 10µM a 50µM

Foi obtido uma reta linear com coeficiente de determinação (R2) de 0,9998 confirmando-se a linearidade de leitura das concentrações adotadas, pois segundo Causey, Hill e Phillips (1990) o coeficiente de determinação da curva de calibração é um indicador de linearidade, o qual deve-se apresentar um valor de pelo menos 0,99.

Para expressar o desvio padrão relativo, o termo repetitividade é adotado pelo Vocabulário Internacional de Metrologia46, sendo utilizado pelo INMETRO. A repetitividade envolve várias medições da mesma amostra, em diferentes preparações e é, algumas vezes, denominada precisão intra-ensaio (RIBANI et al., 2004).

Estudos comprovam a atividade antioxidante de plantas utilizando o método de DPPH. Pessuto et al (2009) avaliaram a atividade antioxidante de Maytenus ilicifolia, o qual mostrou que a capacidade antioxidante pelo método do radical DPPH foi diretamente proporcional ao teor de polifenóis totais encontrados no extrato. Rosa et al (2010) avaliaram a atividade antioxidante pelo método DPPH e o teor em compostos fenólicos totais do extrato bruto metanólico e frações das folhas da espécie Palicourea rigida Kunth, bem como, Lima et al (2006) avaliaram a atividade antioxidante do extrato hidroálcoólico de folhas de Arctium lappa, e Grassi-Zampieron (2009) avaliaram as atividades antioxidante e captora de radicais livres, de Achyrocline alata (Kunth.) DC. e Achyrocline satureioides (Lam.) DC.

São as substâncias que apresentam núcleo fenólico como, tocoferol, flavonoides, carotenoides, terpenoides, fenólicos e taninos que atuam como captores de ERO (radicais livres que possuem o elétron desemparelhado centrado nos átomos de oxigênio) e podem produzir e quelar íons ferro catalizadores de peroxidação lipídica (AL-MAMARY et al., 2002; BARREIROS, 2006). Segundo Güntzel (2008), essas substâncias apresentam destaque como antioxidante, principalmente os compostos fenólicos e flavonoides, os quais determinam a potencial atividade antioxidante do extrato da C. sylvestris, atuando como sequestradores de radicais livres.

Na figura 3 encontra-se a curva realizada frente as três diluições realizadas com o extrato.

Figura 3 - Valores referentes as diluições dos extratos em relação a suas absorbâncias
Figura 3 – Valores referentes as diluições dos extratos em relação a suas absorbâncias

O potencial do extrato em sequestrar radicais livres foi expresso como concentração final do extrato necessária para inibir a oxidação do radical DPPH em 50%. Quanto menor o valor de EC50 (concentração de extrato em mg/L capaz de reagir com 50% do radical presente na solução de DPPH) maior é sua atividade antioxidante, pois será necessária uma menor quantidade de extrato para reduzir 50% do radical livre DPPH (ROESLER et al., 2007). O extrato da C. Sylvestris apresentou EC50 de 1.734 mg/L e 0,14g extrato/g DPPH.

CONCLUSÃO

O estudo demonstrou que a escolha do solvente para produção do extrato foi eficiente, pois verificou a presença dos metabólitos vegetais pesquisados, comprovando sua eficácia no processo extrativo empregado. Foi possível quantificar polifenois totais do extrato e avaliar sua atividade antioxidante utilizando a técnica de DPPH.

Considerando que substâncias naturais podem ser responsáveis pelo efeito de proteção contra os riscos de muitos processos patológicos, os resultados descritos neste trabalho estimulam a continuidade dos estudos para avaliar a ação antioxidante de substâncias isoladas da espécie Casearia sylvestris.

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[1] Centro Universitário Hermínio Ometto – Uniararas, Araras, SP. Discente do Curso de Farmácia.

[2] Centro Universitário Hermínio Ometto – Uniararas, Araras, SP. Docente do curso de Farmácia.

 

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