ARTIGO ORIGINAL
FERREIRA, Rafael André [1], VELLOSO, Ricardo Viana [2]
FERREIRA, Rafael André. VELLOSO, Ricardo Viana. Staphylococcus Aureus resistentes à meticilina (MRSA): Uma revisão sobre os mecanismos de resistência e as principais técnicas utiilizadas em sua identificação. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano 06, Ed. 01, Vol. 06, pp. 29-38. Janeiro de 2021. ISSN: 2448-0959, Link de acesso: https://www.nucleodoconhecimento.com.br/biologia/mecanismos-de-resistencia
RESUMO
O presente artigo tem como objetivo discutir os diferentes mecanismos de resistência, as técnicas disponíveis atualmente para identificação de microrganismos isolados de MRSA, a aplicação destes métodos de discriminação de cepas e seu uso na investigação epidemiológica bem como práticas de controle de infecção. A abordagem requer considerar que o Staphylococcus aureus está implicado em uma variedade de infecções que variam de infecções de tecidos moles a infecções do tecido ósseo, pneumonia e endocardite. Ambas as infecções adquiridas na comunidade ou em hospitais relacionadas a Staphylococcus aureus, aumentaram nas últimas duas décadas e esse aumento na incidência foi acompanhado por um aumento de cepas resistentes a antibióticos, em particular à meticilina. Estes últimos são denominados os Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA). Vários mecanismos de resistência têm sido descritos. A identificação dos MRSA é essencial para entender as tendências epidemiológicas e iniciar estratégias de controle de infecção. Métodos baseados em fenótipos são fáceis de executar e interpretar, além de ter um custo relativamente baixo, porém são menos discriminatórios. Já os métodos genotípicos, que têm a vantagem de serem mais discriminatórios, são mais caros e tecnicamente exigentes. No entanto, não há consenso sobre o melhor método de identificação. Em relação a esses métodos podemos citar a eletroforese de campo pulsado em gel (PFGE), que é continua sendo o padrão-ouro para caracterização de cepas e os métodos de sequenciamento de DNA, que requerem conhecimento técnico e aumento de custo. Os dados relatados foram obtidos por meio de revisões da literatura durante o segundo semestre de 2019 e primeiro semestre de 2020, por meio de pesquisa em livros e revistas científicas, e em sites de busca: www.scielo.com.br e www.pubmed.com.br.
Palavras-Chave: Staphylococcus aureus, MRSA, meticilina.
INTRODUÇÃO
O presente artigo tem como objetivo discutir os diferentes mecanismos de resistência, as técnicas disponíveis atualmente para identificação de microrganismos isolados de MRSA, a aplicação destes métodos de discriminação de cepas e seu uso na investigação epidemiológica bem como práticas de controle de infecção.
Nesse sentido é importante ter presente que o Staphylococcus aureus causa uma variedade de infecções supurativas (com formação de pus) e liberação de toxinas em humanos. São agentes causadores de lesões superficiais cutâneas como furúnculos, infecções mais graves como pneumonia, flebite, meningite, infecções do trato urinário e infecções profundas como osteomielite e endocardite. S. aureus é uma das principais causas de infecção hospitalar adquirida (nosocomial) de feridas cirúrgicas.
Embora Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA) foram encontrados em ambientes hospitalares por várias décadas, cepas de MRSA foram recentemente identificadas fora do hospital, tornando-se conhecidas como associada à comunidade (CA-MRSA) (TODAR, 2012). Cepas resistentes à meticilina de Staphylococcus aureus foram identificadas pela primeira vez em 1961, um ano após o início do uso de antibióticos no tratamento de infecções por Staphylococcus aureus. MRSA são resistentes a todos os antibióticos betalactâmicos. Isso inclui todas as penicilinas e cefalosporinas, se tornando, assim, um desafio para o tratamento.
1. DIFERENTES MECANISMOS DE RESISTÊNCIA E TÉCNICAS DISPONÍVEIS PARA IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS ISOLADOS DE MRSA
O desenvolvimento deste trabalho requer a consideração do material e dos métodos utilizados, cuja descrição se dá a partir de revisões da literatura feitas durante o primeiro semestre de 2020, por meio de pesquisa em livros e revistas científicas relacionadas à área de Análises Clínicas. com ênfase em Microbiologia Clínica, privilegiando artigos científicos disponíveis em sites de busca como Scielo e PubMed.
Com lastro nas referidas fontes, são apreciados os diferentes mecanismos de resistência, as técnicas disponíveis atualmente para identificação de microrganismos isolados de MRSA, a aplicação destes métodos de discriminação de cepas e seu uso na investigação epidemiológica bem como práticas de controle de infecção.
2. CONCEITOS E PRÁTICAS NA INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA E PRÁTICAS DE CONTROLE DE INFECÇÃO
O desenvolvimento do trabalho perpassa a consideração de conceitos e práticas que são descritos e, ao mesmo tempo, são relacionados, na composição dos processos, conforme passamos a descrever.
2.1 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
As cepas resistentes à meticilina normalmente transportam o gene mecA que codifica uma proteína de ligação à penicilina (PBP2a). Na maioria das cepas, mecA faz parte de um cromossomo móvel integrado chamado cassete estafilocócica (SCCmec). Esta PBP2a possui um peptidoglicano com atividade de transpeptidase, com afinidade por antibióticos beta-lactâmicos (FUDA, 2004). Cepas homogêneas de MRSA produzem PBP2a constitutivamente (BOYCE, 1987). Um outro fator com atividade autolítica pode mediar a resistência à meticilina. Em cepas meticilina sensíveis, a autólise é desencadeada pela inibição da ligação cruzada de peptidoglicano como ocorre com betalactâmicos (BRUNS, 1987). Existem, também, cepas heterorresistentes em que todas as células na população de teste têm os elementos genéticos (gene mecA) para resistência à oxacilina, mas nem todas as células expressam essa resistência. Acredita-se que o mecanismo de heterorresistência em S. aureus envolve a interação do PBP2a e vários produtos gênicos, como os codificados por genes que estão envolvidos na síntese da parede celular, fator essencial para a resistência à meticilina (MARANAN, 1997).
Mc. Dougal L.K. e Thornsberry, em 1986, descreveram um mecanismo de susceptibilidade reduzida à meticilina devido à hiperprodução de penicilinases estafilocócicas normais. Uma base para esta hipótese vem da ausência de PBP2a em suas paredes celulares e da observação de que o ácido clavulânico reduz a CIM da oxacilina em várias vezes (MONTANARI, 1990; SIERRA-MADERO, 1988; CHAMBERS, 1989). A diferença entre os dois mecanismos é que a resistência devido ao PBP2a é mediada por cromossomo, enquanto a hiperprodução de beta-lactamases em BORSA é mediada por plasmídeo.
Foi sugerido um terceiro mecanismo de redução à suscetibilidade à meticilina, em que as cepas com MIC de meticilina de 4μg/ml e CIM de oxacilina de 1μg/ml a 2μg/ml possuam PBPs normais, mas não a PBP2a específica. Eles foram designados MODSA. Essas cepas produzem PBPs 1 e 2 de tamanho molecular normal, mas com baixa afinidade por antibióticos beta-lactâmicos, em contraste com os microrganismos intrinsecamente resistentes, os quais contém PBP2a de diferentes isoformas (TOMASZ, 1989). Portanto, atualmente existem dois mecanismos para descrever cepas de S.aureus com limites resistência ou susceptibilidade reduzida a penicilinas semissintéticas BORSA e MODSA. Ambos os grupos são geneticamente distinto do MRSA.
2.2 A IMPORTANCIA DA DETECÇÃO E TIPAGEM DE MRSA
Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é uma causa de infecções nosocomiais em todo o mundo. O uso de métodos eficientes e uma tipagem epidemiológica precisos são um pré-requisito para o monitoramento, limitando, assim, a ocorrência e disseminação de clones epidêmicos dentro e entre hospitais. A identificação de S.aureus dependia principalmente de características fenotípicas (suscetibilidade ou não a antibióticos) mas, nas últimas duas décadas, uma variedade de tecnologias moleculares foram desenvolvidas (STOMMENGER, 2008).
2.3 ANTIBIOGRAMA, USO DE CEFOXITINA, ÁGAR DE OXACILINA E MICRODILUIÇÃO EM CALDO
A identificação por antibiograma envolve a comparação de susceptibilidades de isolados a uma variedade de antibióticos. Essa técnica é fácil de executar, barata, fornece resultados rápidos e está disponível em todos os laboratórios de microbiologia.
Já a técnica que usa a suspensão padrão de McFarland do isolado é realizada em placa de ágar Mueller Hinton, onde um disco de 30μg de cefoxitina, por exemplo, é colocado e incubado a 37ºC por 18 horas, com o diâmetro do halo medido ao final. Uma zona menor que 20mm é interpretado como sensível e maior que 19mm é considerado resistente (MIMICA, 2007). Por outro lado, a pesquisa em ágar contendo 6 g/ml de oxacilina pode ser incorporado às placas de ágar Mueller Hinton contendo 4% de NaCl. A suspensão do organismo de teste de 0.5 McFarland é incubada a 35 °C por 24 horas. Qualquer crescimento após 24 horas é considerado resistente à oxacilina (MIMICA, 2007). No caso da microdiluição em caldo, a meticilina ou oxacilina podem ser incorporadas ao caldo Muller Hinton com NaCl a 2%. A densidade de inoculo de 5×105 UFC/ml é incubação a 33-35ºC por 24 horas (MIMICA, 2007).
2.4 TESTE DE AGLUTINAÇÃO POR LÁTEX, BIOTIPAGEM E SOROTIPAGEM
Nakatomi e Sugiyama (1998) desenvolveram um simples e rápido método de aglutinação em lâmina para detectar proteína de ligação à penicilina (PBP2a) de isolados de estafilococos. A ferramenta contém partículas de látex sensibilizadas com um anticorpo monoclonal contra PBP2a (STOMMENGER, 2008).
Coia e colaboradores (1990) propuseram um esquema de biotipagem baseado em propriedades bioquímicas e metabólicas usando a hidrólise de Tween-80, produção de urease, produção de pigmento no ágar Tween 80 e resistência à gentamicina (STOMMENGER, 2008).
Por outro lado, a sorotipagem de Staphylococcus aureus detecta diferenças no antígeno do polissacarídeo capsular, proteínas de membrana e lipopolissacarídeos. (SCHLICHTING, 1993). Assim, sorotipagem pode ser realizada usando diferentes testes sorológicos como aglutinação bacteriana, aglutinação em látex, co-aglutinação e ensaios de marcação enzimática.
2.5 ANÁLISES ELETROFORÉTICAS E IMUNOBLOTTING
Vários métodos eletroforéticos, como imunotransferência e zimotipagem foram usados para identificar cepas de MRSA. Nesse caso, as proteínas da célula inteira são extraídas, separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e coradas para comparar com as proteínas extraídas de outras linhagens. No entanto, este teste apresenta baixo poder de discriminação (SCHLICHTING, 1993). No imunoblotting podem ser usados produtos de eletroforese de SDS-PAGE, os quais são transferidos para a membrana de nitrocelulose e expostos a antissoros criados contra cepas específicas. Os anticorpos ligados são então detectados por anti-imunoglobulinas marcadas com enzima. Além disso, podemos citar a eletroforese enzimática multifoco (MLEE), que envolve a extração de enzimas, posterior separação por eletroforese e exame por coloração seletiva. A migração de enzimas depende da carga de seus aminoácidos. A taxa de identificação e reprodutibilidade são consideradas boas para esse método. Uma alternativa às técnicas de eletroforese seria a zimotipagem, a qual é baseada em propriedades eletroforéticas da enzima esterase. S. aureus possui três esterases designadas A, B e C. Os resultados são analisados de acordo com as diferenças observadas na mobilidade das esterases em diferentes cepas (SCHLICHTING, 1993).
2.6 MÉTODOS GENOTÍPICOS
A primeira técnica molecular utilizada para a investigação epidemiológica de MRSA foi a análise de plasmídeo. Os isolados são diferenciados de acordo com o número e tamanhos de plasmídeos transportados por um isolado. A reprodutibilidade deste método é difícil devido a ocorrência de plasmídeos existentes em diferentes formas como superenroladas, cortadas ou lineares, em que cada uma migra de maneira diferente na eletroforese (GASTON, 1988).
Existe, também, a análise enzimática de restrição (REA) de DNA cromossômico. Esta técnica parte do princípio de que o DNA cromossômico é grande demais para uma análise completa e deve ser cortado em pedaços menores usando enzimas restrição que reconhecem e clivam sequências específicas. O número e tamanho desses fragmentos de restrição gerados depende da sequência de reconhecimento da enzima e composição do DNA. Estes fragmentos são separados de acordo com seu tamanho na eletroforese em gel de agarose. Os padrões são marcados por brometo de etídio e examinados sob luz UV. Todas as cepas de MRSA podem ser identificadas com boa reprodutibilidade (JORDENS, 1988).
Uma alternativa seria a análise Southern blot, em que os fragmentos gerados pela digestão de DNA, por endonucleases, são separadas por eletroforese em gel e são transferidos para membrana de nitrocelulose. Os fragmentos contendo sequências específicas são detectadas por sondas de DNA marcadas. As variações em número e tamanhos dos fragmentos detectados são referidas como Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP) (HOOKEY, 1998).
Ainda existe a ribotipagem, que é usada para a identificação de MRSA com alguma variação nas enzimas de restrição e tipo de sonda empregado. As sondas geralmente usadas são marcadas com radioisótopo ou biotiniladas (PREVOST, 1992).
2.7 TIPAGEM BASEADA EM PCR E SUAS VARIAÇÕES
Baseado na heterogenicidade dentro da sequência específica do gene da coagulase, a PCR é usada para gerar um produto de amplificação, o qual é comparado com padrões previamente estabelecidos. Esta técnica se tornou uma ferramenta de linha de frente para identificação epidemiológica de Staphylococcus aureus. (STOMMENGER, 2008).
Além disso, é possível usar a técnica conhecida como AP-PCR / RAPD PCR, em que um iniciador arbitrário ou DNA polimórfico aleatório é amplificado com base no pressuposto de que sempre haverá algum DNA suficientemente semelhante aos primers para que seja aleatoriamente amplificado. Envolve amplificação aleatória de segmentos de DNA usando pequenos iniciadores de sequências arbitrárias de nucleotídeos de homologia desconhecida com uma sequência alvo. A técnica é simples, rápida e útil no estudo de cepas de surtos, mas não é adequado como método de referência para a identificação de MRSA (MEHNDIRATTA, 2012).
Mehndiratta (2009) propôs a análise de sequência de elementos repetitivos (Rep-PCR), que é baseado na PCR e faz amostragem de todo cromossomo. São utilizados primers que hibridizam com sequências conhecidas por serem repetidas em todo o cromossomo, mas com número e posição variável. O DNA entre esses locais de ligação é amplificado e o polimorfismo de comprimento produz uma “impressão digital”. O PCR-RFLP depende da amplificação de um fragmento definido de DNA e subsequente digestão do produto amplificado com uma enzima de restrição para gerar polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição.
Enright (2000) utilizou uma técnica que envolve um tipo de sequência multiloco (MLST) e relatou que este tipo de sequência é útil para estudar a evolução clonal de MRSA, baseando-se na análise de sequência de vários genes de regulação. Sete genes de regulação foram estudados: arcC, aroE, glpF, gmk, pta, tpi e yqiL. As sequências de cada gene são designadas como alelos distintos e cada cepa de MRSA é definida pelos alelos dos sete genes.
CONCLUSÃO
A identificação bacteriana muitas vezes é dificultada, porque os métodos tradicionais, como por exemplo analise da coloração de Gram, testes bioquímicos cultura nem sempre possibilitam a classificação bacteriana correta. Além disso, as características fenotípicas de cada espécie podem se apresentar de forma muito variável, e com resultados muito próximos e de difícil analise para espécies intimamente aparentadas. Existem diversos métodos diagnósticos bacterianos utilizados no diagnóstico, controle, prevenção e tratamento das enfermidades causadas por estes agente. Os métodos fenotípicos, como a cultura e métodos bioquímicos, são fáceis de executar e não exigem o conhecimento técnico demandado pelos métodos genotípicos ou moleculares. Os primeiros podem ser também executados em ambiente com pouco recurso. A análise de fragmentos de DNA por gel em eletroforese, pode ajudar na distinção de várias cepas relacionadas e, portanto, seria adequado para uma investigação de surtos. No entanto, é difícil padronizar e consome mais tempo que os métodos de PCR, uma vez que requer uma cultura de bactérias. O método de análise por PCR, bem como suas variações, foram, comprovadamente confiáveis e reproduzíveis. A escolha do método de identificação dependerá de cada solicitação, recursos disponíveis e experiência do laboratório.
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[1] Doutorando em Bioquímica e Imunologia, Mestre em Bioquímica e Imunologia, Especialista em Hematologia e Imuno-hematologia, Especialista em Biomedicina Estética, Graduado em Biomedicina, Graduado em Formação Pedagógica para Graduados Não Licenciados – Biologia.
[2] Doutor em Educação, Mestre em Educação. Especialista em Ensino de Língua Portuguesa. Especialista em Direito Civil. Especialista em Psicopedagogia. Licenciado em Letras. Licenciado em Pedagogia. Bacharel em Direito.
Enviado: Setembro, 2020.
Aprovado: Janeiro, 2021.
