Assepsia de Sementes e Segmentos Nodais de Eugenia Punicifolia (Kunth) D.C. de Genótipos da Amazônia Brasileira e Avaliação das Taxas de Germinação In Vitro e Ex Vitro das Sementes desta Planta Medicinal

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DOI: 10.32749/nucleodoconhecimento.com.br/biologia/sementes-e-segmentos
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ALVES, Josiel Rodrigues; LIMA, Erivan Souza de; BARBOSA, Edilson Pinto; MALOSSO, Milena Gaion

ALVES, Josiel Rodrigues; et.al. Assepsia de Sementes e Segmentos Nodais de Eugenia Punicifolia (Kunth) D.C. de Genótipos da Amazônia Brasileira e Avaliação das Taxas de Germinação In Vitro e Ex Vitro das Sementes desta Planta Medicinal. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano 03, Ed. 08, Vol. 07, pp. 56-68, Agosto de 2018. ISSN:2448-0959

Resumo

A pedra-hume-caá é popularmente utilizada como insulina no tratamento do diabetes. Suas sementes têm problemas de germinação e, visando produzir biomassa em larga escala, este trabalho objetivou avaliar a taxa de germinação de sementes e propor um protocolo de assepsia de sementes e segmentos nodais. Assim, ambos os explantes foram imersos em solução de Derosal 1% por 1 hora, álcool 70% por 1 minuto e solução de NaClO a 0,1; 0,50 e 1,0%, por 30 minutos, lavados com água estéril, inoculados em meio WP e mantidos em sala de crescimento por 30 dias, quando avaliamos presença de microrganismos e a taxa de germinação. A solução de 1% de NaClO foi eficiente para desinfestar ambos os tipos de explantes e, devido a baixa taxa de germinação e ao longo período de dormência das sementes, conclui-se que a micropropagação é a metodologia mais indicada para a produção de biomassa desta espécie.

Palavras-chave: Desinfestação, Pedra-hume-caá, Atividade Antidiabética.

Introdução

A Eugenia punicifolia (Kunth) D.C., é um arbusto de caule cilíndrico, de casca revestida por uma epiderme que se destaca em placas irregulares, que ao se desprender expõe a nova epiderme de coloração amarela, com manchas claras, apresentando aspecto arbustivo até aéreo, podendo atingir até 3,0 m de altura. Possui crescimento clonal e em uma mesma formação arbustiva é possível encontrar de 10 a 50 ramos saindo do solo, oriundos da mesma ligação vegetativa. As folhas são elípticas ou lanceoladas, opostas e pecioladas, com 6,0 cm de comprimento por 2,0 cm de largura. Tem inúmeras flores dispostas em panículas, de coloração branca. O fruto é vermelho escuro quando maduro e se encontra como uma baga glabosa, dotada de polpa comestível e adstringente (Grandtner & Chevrette 2013). Este vegetal é popularmente conhecido na região amazônica como murta, pedra-hume e pedra-hume-caá ou insulina vegetal, sendo uma planta medicinal que ocorre na Amazônia e é popularmente utilizada no tratamento contra diabetes. É uma espécie do gênero Eugenia, pertencente à família Myrtaceae, composta por cerca de 3.000 (três mil) espécies e 80 (oitenta) gêneros, o que a destaca como uma das famílias mais importantes devido à sua distribuição em todos os ecossistemas brasileiros, sendo o gênero Eugenia um dos maiores, com mais de 500 (quinhentas) espécies, das quais 400 (quatrocentas) se encontram no Brasil e assumem destaque especial por serem utilizadas como medicinais (Silva & Pinheiro 2007). De acordo com Oliveira et al. (2005), muitas plantas deste gênero são utilizadas popularmente como medicinais e alguns estudos já comprovaram a presença de substâncias com potencial uso medicinal em algumas espécies deste gênero, tais como a decocção de folhas de E. uniflora, rica em flavonoides, que é utilizada no controle da hipertensão e da gota. A atividade anticonvulsionante do óleo essencial de E. caryophyllata está relacionada aos constituintes eugenol e carvacrol, bem como trabalhos realizados com E. spitata e E. dysenterica demonstraram potencial antimicrobiano em seu óleo essencial. Atividades acaricida e inseticida também foram reportadas no óleo essencial de A. Caryophyllata. Estudos realizados por estes mesmos autores demonstraram que os componentes principais do óleo essencial de E. punicifolia (Kunth) D.C. são sequiterpenos e monoterpenos, apresentando nesta última classe de substâncias em grande abundância o carifileno e o linalol, sendo que este último apresenta grande importância para as indústrias de cosmético e alimentícia, já que é utilizado como fixador de substâncias. Trabalhos realizados por Rodrigues (2010) demonstraram que o linalol apresenta atividade antinflamatória e antinoceciptiva, anestésico local, anti-leishmaniose, antimicrobiano, anticonvulsante. Esta espécie é bastante visada pela indústria farmacêutica por ser utilizada no tratamento contra a diabetes, sendo, inclusive, popularmente conhecida no Amazonas como insulina vegetal, e possuindo também esta atividade farmacológica comprovada por Grangeiro et al. (2006). Devido à sua utilização como fixador nas indústrias de cosméticos e alimentos e intenso uso popular por sua ação farmacológica, aliado ao longo tempo de dormência pré-germinação de suas sementes em ambiente in vivo, esta planta corre risco de extinção devido à coleta indiscriminada dos frutos. Por isso, é uma atitude urgente utilizar metodologias biotecnológicas para a concreta conservação in vitro desta espécie através da elaboração de um protocolo de inserção desta espécie in vitro, que é o objetivo deste trabalho, visando uma alternativa útil e racional para a conservação desta planta, uma vez que, a partir do estabelecimento de plantas axênicas in vitro, pode-se multiplicar infinitamente estes acessos através da micropropagação, que é uma técnica de cultura de tecidos vegetais que pode, eventualmente, tornar-se um método mais promissor de propagação, permitindo a obtenção de inúmeras plantas isentas de vírus, geneticamente uniformes e em curto espaço de tempo, representando um método alternativo de propagação vegetativa para esta espécie (Leitzek 2009).

A primeira etapa a ser realizada em um protocolo de micropropagação é a assepsia, que visa a obtenção de explantes livres de patógenos, geralmente do tipo sementes ou segmentos nodais, para a iniciação do cultivo in vitro da espécie-alvo. Para isso, são realizados diversos tratamentos com diferentes tipos e concentrações de agentes antimicrobianos como fungicidas e antibióticos, hipoclorito de sódio ou de cálcio, entre outros, em diversas concentrações, que geralmente variam entre 0,10 a 3,0%, em diversos tempos de exposição (de 10 minutos a 1 hora), além de soluções adstringentes como o álcool 70%, geralmente durante 1 minuto (Pelizza et al. 2013). Assim, com o estabelecimento deste protocolo, espera-se dar início ao protocolo de uma metodologia alternativa de propagação e cultivo de mudas-elite em curto espaço de tempo, geneticamente uniformes, livres de patógeno e com fitossanidade garantida, o que permitirá o abastecimento de biomassa para uso nas indústrias farmacêuticas, de cosméticos e alimentícios, sem a necessidade da retirada de acessos do meio ambiente, evitando a erosão genética e até mesmo, a possível extinção desta espécie.

Material e métodos

Todos os experimentos foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Instituto de Saúde e Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas no município de Coari.

A assepsia de diversos tipos de explantes é requisito para a iniciação do cultivo in vitro de uma espécie e esta etapa é denominada de fase de estabelecimento. Então, para o estabelecimento in vitro de E. punicifolia (Kunth) D.C, realizou-se uma assepsia básica das sementes coletadas de plantas matrizes localizadas na área verde do mini-campus da UFAM de Manaus, que inicialmente foram despolpadas, lavadas com detergente neutro e enxaguadas abundantemente em água corrente. Na sequência, foram imersas em solução de Derosal 1% (v/v) por 1:00 hora sob agitação orbital constante a 100 rpm e, em seguida, imersas em álcool 70% durante 1 minuto e depois mergulhadas em solução de hipoclorito de sódio a 0,1; 0,5 e 1,0%, respectivamente, por 30 minutos, sob a mesma agitação. Posteriormente, as sementes foram banhadas quatro vezes com água destilada estéril e então inoculadas em tubos de ensaio meio de cultura WP basal acrescido de 20,0 g/L de sacarose e 8,0 g/L de agar-agar, com pH aferido a 6.0.  As sementes foram mantidas em condições de sala de crescimento e, após 30 dias de inoculação foram avaliadas quanto à presença de microrganismos e a taxa de germinação, sendo que esta última foi avaliada de 15 em 15 dias, por um período de 150 dias.

Objetivando a inserção in vitro de plantas matrizes com potencial agronômico, tais como genes de resistência ao estresse hídrico, salínico, luminoso, entre outros, ou resistentes a diversos tipos de patógeno, ou ainda altamente produtivos, foi também montado um experimento de assepsia básica de segmentos nodais da espécie alvo deste estudo. Para isso, plântulas mantidas na casa de vegetação do Instituto de Saúde e Biotecnologia, por cerca de 180 dias, foram fonte de segmentos nodais para este experimento. Neste experimento, os segmentos nodais foram excisados das plântulas matrizes submetidos à assepsia idêntica a utilizada para as sementes. Além das taxas de contaminação por fungos e bactérias, foram também analisadas as taxas de oxidação através da avaliação visual dos tecidos oxidados e a taxa de sobrevivência através da análise visual dos explantes sadios.

Visando ainda a comparação das taxas de germinação in vitro e ex vitro, foi montado um experimento de germinação de sementes E. punicifolia (Kunth) D.C em 3 bandejas de polipropileno branco (35,0 cm de comprimento X 25,0 cm de largura X 8,0 cm de altura) L contendo 100% terra na primeira, 100% areia na segunda e 50% terra + 50% areia na terceira, onde foram plantadas 30 sementes em cada tipo de substrato, sendo todos regados com água corrente diariamente e avaliado a cada 3 dias. Neste experimento foram utilizadas 90 sementes.

Os explantes, durante as fases de estabelecimento in vitro, tanto de sementes como de seguimentos nodais, foram mantidos em condições de sala de crescimento, ou seja, à temperatura de 25 ± 2ºC, sob iluminação artificial de 30 μmol m-2. s-1 e fotoperíodo de 16 horas de luz.

Para a realização dos testes de assepsia básica foram utilizadas um total de 90 sementes e de 90 segmentos nodais, divididos em 3 repetições de 10 sementes para cada um dos 3 tratamentos. Em todos os experimentos, o delineamento estatístico utilizado foi o inteiramente casualizado, expresso em porcentagem simples e os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA). Caso apresente diferenças entre os grupos, as médias foram comparadas pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de significância (Mondo et al. 2008).

O meio WP (Wood Plant) foi escolhido para este trabalho por ser um meio específico para o cultivo in vitro de plantas lenhosas (Mantovani, 2001), o que é o caso da E. punicifolia (Kunth) D.C.

Resultados e discussão

De acordo com Almeida et al. (2008), o cultivo in vitro é um método viável para propagação clonal e massal de diversas espécies florestais, porém, um dos maiores entraves para o estabelecimento in vitro destas espécies está na dificuldade de obter tecidos livres de contaminações provocadas por fungos e bactérias e ainda por oxidações provocadas por compostos fenólicas. Ainda segundo este mesmo autor, a desinfestação dos segmentos nodais das espécies lenhosas é a primeira etapa a ser considerada para a realização de um estabelecimento in vitro ótimo e que os níveis de contaminação tendem a ser maiores quando as plantas matrizes utilizadas como fonte de explantes são provenientes do campo, mas que, no entanto, mesmo a plantas submetidas a rigorosos controle fitossanitário e mantidas em viveiro protegido ou casa de vegetação são fontes potenciais de microrganismos, que pode tornar o procedimento de cultivo in vitro  limitante.

Tabela 01: Assepsia básica de sementes e segmentos nodais de Eugenia punicfolia (Kunth.) D. C.

Concentração de Hipoclorito de Sódio (%)Contaminação por Fungos (%)Contaminação por Bactérias (%)Taxa de Germinação* de Semente e Sobrevivência de Segmentos Nodais (%)
SementesSegmentos
Nodais
SementesSegmentos
Nodais
SementesSegmentos
Nodais
0,159,00 b70,00 a4,17 a30,00 a10,00 a0,00
0,550,00 b70,00 a4,17 a30,00 a10,00 a0,00
1,067,00 a40,00 b0,00 b30,00 a6,33 b0,00

 

* Taxa de germinação obtida aos 150 dias de observação.

Ao analisar a Tabela 01, verifica-se que a contaminação das sementes por fungos foi diminuindo à medida que a concentração de hipoclorito de sódio foi aumentada. Já a contaminação por bactérias manteve-se estável a 4,17% nas concentrações mais baixas deste agente desinfestante. Com relação à taxa de germinação, pode-se concluir que aos 30 dias de inoculação nenhuma semente havia germinado. No entanto, a observação contínua do experimento, demonstrou que aos 90 dias de cultivo in vitro, 10% das sementes germinaram nas concentrações mais baixas de hipoclorito de sódio, enquanto apenas 6,33% germinaram nas taxas mais altas do mesmo. Assim, pode-se concluir que embora altas taxas de hipoclorito de sódio utilizados nos experimentos de assepsia  tenham induzido uma taxa mais baixa de germinação nas sementes durante o período observado, não houve diferença estatística significativa observada para estes tratamentos. Desta forma, fica indicada a concentração de 1,0% de hipoclorito de sódio para a assepsia de sementes de Eugenia punicifolia (Kunth) D.C., para iniciar o cultivo axênico in vitro desta planta medicinal. Malosso et al. (2008, 2012), observaram o mesmo resultado em jambu e carobinha.

Com relação à assepsia básica dos seguimentos nodais, a Tabela 01 indica que a taxa de 1,0% de hipoclorito de sódio induziu a menor taxa de contaminação por fungos (40%) e que a porcentagem de contaminação por bactérias permaneceu a 30% em qualquer uma das concentrações testadas e que não houve brotação de nenhum dos segmentos nodais porque 100% destes oxidaram e morreram. Assim, pode-se verificar que, embora a concentração de 1% de hipoclorito de sódio seja eficiente para desinfestar os segmentos nodais desta espécie, é necessária a realização de novo experimento com acréscimo de ácido ascórbico ao meio de cultura visando eliminar a oxidação fenólica dos explantes excisados. Ao cultivar a teca, Junior et al. (2009), também encontraram grandes problemas com relação à produção de compostos fenólicos nos segmentos nodais durante o estabelecimento in vitro e afirmaram que a utilização de solução de ácido bórico e ácido ascórbico a 0,1 % tem apresentado resultados satisfatórios para a minimização dos efeitos da oxidação com relação às oxidações no cultivo de teca.

A germinação das sementes é influenciada por fatores ambientais, tal como o substrato, que pode ser manipulado a fim de otimizar a porcentagem, velocidade e uniformidade de germinação, resultando na obtenção de plântulas mais vigorosas e na redução de gastos de produção (PACHECO et al. 2006). Este mesmo autor explica que o substrato tem a função de suprir as sementes de umidade e proporcionar condições adequadas à germinação e posterior desenvolvimento das plântulas, devendo manter uma proporção adequada entre a disponibilidade de água e a aeração, de modo a evitar a formação de uma película aquosa sobre a semente, o que impedirá a penetração do oxigênio na semente e favorecer a proliferação de patógenos. Por isso, ao escolher um substrato, alguns aspectos devem ser considerados, tal como o tamanho da semente, a exigência luminosa e de unidade e a facilidade que ele oferece durante a instalação e realização das contagens e a avaliação das plântulas, sendo os principais prescritos e recomendados nas Regras para Análise de Sementes (BRASIL, 1992) o papel, solo e areia.

Tabela 2: Germinação de sementes de Eugenia punicifolia (Kunt) D. C. sob condições ex vitro.

Número de Raízes Germinadas
Dias de InoculaçãoAreiaArgilaAreia/Argila (1:1)
90300
105013
120000
135325
150202
Total8310
Taxa de Germinação26,66%10,00%33,33%

 

De acordo com a Tabela 2, as primeiras sementes germinaram com cerca de 90 dias de inoculação em substrato areia e continuaram germinando após 150 dias da montagem do experimento. Pode-se verificar também nesta tabela que a menor taxa de germinação (10,00%) ocorreu em solo com característica de grande retenção de água enquanto as maiores taxas de germinação (33,33%) ocorreram em solo com retenção média de água. Com isso, constatou-se que os substratos testados nesse trabalho influenciaram a germinação de sementes de pedra-hume-caá, conforme análise dos resultados. Assim, é provável que capacidade de retenção de água de cada substrato, aliado a características intrínsecas que regulam o fluxo de água para as sementes possam ter influenciado os resultados (Bezerra et al. 2004), uma vez que a variação na disponibilidade de água dos substratos, fator comum nesse tipo de trabalho, causa frequentemente prejuízos à germinação das sementes, provocando diferenças entre as  porcentagens.

Os resultados das taxas de germinação observadas após 150 dias indicam que trata-se de uma espécie com baixa taxa de germinação e sementes com longo período de dormência, o que leva a problemas de germinação no solo. Estas características também foram notadas durante a análise do processo de germinação em condição in vitro desta planta (M. G. Malosso, dados não publicados).

Assim, tendo em vista a importância econômica desta planta e o perigo de extinção devido à coleta indiscriminada para obtenção de matéria-prima aliada á baixa e lenta taxa de germinação das sementes de pedra-hume-caá, fica indicado neste trabalho a elaboração de um protocolo de micropropagação para a produção de biomassa vegetal em larga escala de mudas, visando o abastecimento da indústria farmacêutica e a conservação da espécie.

Referências

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