ОРИГИНАЛ СТАТЬИ
CASALOTI, Laís Guadalupe [1], SANTOS, Jorge Alexandre Nogueira [2]
CASALOTI, Laís Guadalupe. SANTOS, Jorge Alexandre Nogueira. Ингибирование эластазы ваквого и этаноликого листвятого экстракта Sedum Dendroideum: исследование in vitro. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. 04 год, Эд. 07, Vol. 04, стр. 140-147. Июль 2019 года. ISSN: 2448-0959
РЕЗЮМЕ
Нерегулируемая активность протеаз у человека связана с рядом заболеваний. Нейтрофил Elastase является протеазой, контролируемой ингибитором Антитрипсина (AAT), который естественным образом вырабатывается печенью. Мутации в гене SERPINA 1 вызывают дефицит этого ингибитора, и следствием этого является появление нескольких патологий у человека. Учитывая, что виды растений являются перспективными источниками для открытия новых препаратов, настоящее исследование было направлено на оценку ингибирующего воздействия экстрактов на эластазу, где были найдены значения IC50 в размере 8,1 и 1,4 мл/мл (ваквозный экстракт) и 3,3 и 0,6. г/мл (этанолильский экстракт). Эти результаты показывают, что экстракты дендроида Sedum может быть потенциальным источником биологически активных соединений для открытия новых ингибиторов эластазы.
Ключевые слова: бальзам, IC50, ингибиторы.
ВВЕДЕНИЕ
Протеазы являются важными ферментами для большого количества физиологических процессов, таких как пищеварение белка, размножение, коагуляция крови, система Калликрейн-Кинина и фибринолиз (Отен и Бонд, 2008). У человека нерегулируемая активность протеаз связана с различными патологическими состояниями, такими как рак, воспалительные процессы, тромбоз, артрит, кожные заболевания и эмфизема легких. По этой причине деятельность протеаз ы должна контролироваться и регулироваться (Rawlings et al., 2004). Недавние исследования показали, что протеазы стали важными целями для разработки лекарств. Эластаза является протеаза производится в основном поджелудочной железы и нейтрофилов, и она имеет свойство гидролизных компонентов внеклеточной матрицы, таких как коллаген, эластина, ламинина и протеоглианов (Thomson и Kapadia, 1979). Протеолитическая активность нейтрофильной эластазы строго регулируется эндогенным ингибитором белка под названием З-1-антитрипсин (ААТ). Мутации в гене SERPINA 1, Locus Pi, расположенные на хромосоме 14 (14q31-32), вызывают дефицит AAT (Siedle, et al., 2003). Без присутствия своего естественного ингибитора, эластаза в изобилии генерирует повреждения тканей, так как этот фермент является основным протеаза, выделяемых нейтрофиловами в воспалительных процессах.
Действие эластаза связано с рядом заболеваний, таких как печеночная недостаточность, ревматоидный артрит, псориаз, рак кожи, атеросклероз и несколько легочных патологий (Johansson, 2002). В нормальном легком, альвеолы подвергаются воздействию низких уровней нейтрофил эластаза. Эта протеаза может разрушить эластина в альвеолярной стенке, если она не сдерживается действием ингибитора Антитрипсина. После травмы, легочная ткань не может регенерировать и процесс эмфиземы, астмы, острой травмы легких или муковисцидоза может быть вызвано (Abboud и Vimalanathan, 2008).
Разведка биологически активных соединений из натуральных продуктов находит в видах растений основной и наиболее перспективный источник новых соединений, которые могут выступать в качестве ингибиторов протеазы. Для защиты от травоядных животных и насекомых растения обычно производят вторичные метаболиты, которые включают терпены, полифенолы, дубильные вещества, пептиди и белки (Ibanez et al., 2012). Многие из этих метаболитов являются ингибиторами протеаз и вызывают уменьшение процесса поглощения незаменимых аминокислот для развития насекомых (Cuccilioni et al., 2009).
Вид Sedum Dendroideum, известный в народе как Бальзам , является растением, относящимся к заказу Saxifrales, Moc. Et Sess' ex DC, семейство Crasulaceae является многолетним, сочным, субленозой и ксерофитными видами, происходящими из сухого тропического климата (Epagri,1998). В Бразилии он широко адаптирован и широко известен бальзамом (Milaneze и Гонсалвеш, 2001). Сок его листьев был использован для лечения кожных воспалительных и кровоподтеков, а также внутренне для желудочных нарушений, в связи с смягчающей и лечебной деятельности (Epagri, 1998; Миланезе и Гонзалвез, 2001).
Исследования показывают, что род Sedum представляет соединения различных химических групп, таких как полисахариды (Sendl et al.,1993), дубильные вещества (Stevens et al., 1995), тритерпеноиды с гепатопротекторной активностью (Aimin, et al.,1998), пиперидинические алкалоиды (Halin стр. 1985) и Пирролидик (Harth et al., 1996). И с помощью фитохимического анализа с видом Sedum dendroideum удалось определить наличие Kaempferol, важная молекула с фармакологическими свойствами (Коутиньо, Muzitano и Коста, 2009). Принимая во внимание наличие вторичных метаболитов, найденных в видове, и с учетом его потенциального использования в качестве лекарственного растения, настоящее исследование направлено на проверку того, есть ли ваковые и этиноликовые экстракты растения имеют потенциал для Ингибирование протеолитической активности фермента эластазы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выдержки были подготовлены из листьев Sedum Dendroideum по методологии Хейдари-Сурешджани (2015), в которой свежие и здоровые листья овоща были собраны в окрестности Фурнас (широта 22 No 26 27 " и долгота 46 No 21 03 "), расположенный в Муниципалитет Буэно Брандау.
Около 10 г листьев растения сушат в течение 72 часов в теплице при 40-c и затем измельчают до получения равномерного вида порошка. Затем полученный материал переносится на стеклянный флакон и смешивается с 50 мл дистиллированной воды, оставаясь в покое в течение 12 часов. После этой процедуры смесь была отфильтрована на бумаге Whatman No 1 и получена прозрачная жидкость, не состоявотка частиц. Такая же процедура использовалась для приготовления экстракта этанолика, однако в месте дистиллированной воды использовался этанол 95%.
Для ингибирования анализов были использованы ферментная эластаза свиной поджелудочной железы (E. C 3.4.21.36, 4 U/mg) и его хромогенный субстрат N-succinyl-AlaAla-Ala-P-nitroanilide (Thomson и Kapadia, 1979), которые были приобретены у компании Sigma Aldrich. Фермент (при конечной концентрации 10 мкг/мл) инкубировался в фосфатный буфер натрия (50 мм, рН no 8) с растительными экстрактами в разных концентрациях (в диапазоне от 1 до 20 мл/мл для водного экстракта и вариации от 1 до 8 мл/мл для экстракта этаноля) при 25 o C для Общий окончательный том 990 йл. Через 30 минут в смесь было добавлено 10 00 л субстрата для конечной концентрации 10 м, а гидролиз хромогенного субстрата контролировался в течение 5 минут с помощью спектрофотометра V-M5 Bel Photonics на длине волны 410 нм. В качестве отрицательного контроля использовались фосфатный буфер 50 мМ, рН 8, а также положительный контроль Эпигатэктекина-3-галатат.
Все эксперименты проводились в тройном и данные были представлены как среднее и стандартное отклонение. Значения параметра ингибирования IC50, который является концентрацией экстракта, который подавляет 50% ферментативной активности, были определены процентом оставшегося ингибирования по сравнению с концентрацией экстракта и рассчитаны нелинейным регрессией с использованием GraFit 5.0 Программа (Кожа, 1992). Процент торможения был рассчитан по уравнению:
% ингибирование ABS Контроль – Абс Экстракт (ru) /Abs контроль x 100%
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Графики 1 и 2 показывают процент ингибирования из-за различных концентраций ваквого и алкогольных экстрактов. Эти экстракты ингибируют эластаза с различной интенсивностью. Как показано на графике 1, наивысшее ингибирование (59%) наблюдалось в концентрации 20 мкг/мл ваквого экстракта фермента.
График 1: процент (%) Ингибирование эластазы как функции различных концентраций вавных экстрактов.
На графике 2 мы можем наблюдать, что самое высокое ингибирование (88%) Концентрация составила 8 мкг/мл.
График 2: процент (%) Ингибирование эластазы как функции концентрации этаноликовых экстрактов.
На основе результатов, полученных на графиках 1 и 2, значения IC50 (таблица 1) были рассчитаны для двух экстрактов, 8,1 и 1,4 мкг/мл (aqueous extract) и 3,31 и 0,6 мкг/мл (этанолический экстракт). Эти результаты показывают, что экстракт этанолика представил лучшую силу торможения над эластазой, чем вако-экстракт.
Таблица 1: ЗНАЧЕНИЯ IC50 вакаульных и этанолических экстрактов на эластазе. Значения, выраженные в качестве среднего и стандартного отклонения.
| IC 50 (мкг/мл) | |
| Эластаза | |
| Ваквитый экстракт | 8,1 и 1,4 |
| Экстракт этанолика | 3,3 и 0,6 |
Источник: Автор
Растительные экстракты предоставляют безграничные возможности для открытия новых ингибиторов ферментов, учитывая, что они производят широкий спектр вторичных метаболитов. Эти химические соединения используются растениями для защиты от действий травоядных животных и насекомых, и многие из этих соединений являются ингибиторами нескольких классов протеаз, включая Elastase (Sin s Kim, 2005; Мидлтон и др., 2000).
Как уже говорилось ранее, вид Sedum Dendroideum производит широкий спектр вторичных метаболитов, и эти соединения могут быть вовлечены в ингибирование эластазы.
Выводы
Результаты настоящего исследования показали, что вакозные и этаноликовые экстракты Sedum Dendroideum имели значительную ингибирующую активность на протеолитическую активность эластазы. Необходимы более конкретные исследования для выявления и изоляции биологически активных соединений в экстрактах дендроида Sedum.
BIBLIOGRAPHICAL СПРАВКИ
ABBOUD, R.T.; VIMALANATHAN S. Pathogenesis of COPD. Part I: The role of protease-antiprotease imbalance in emphysema. International Journal of Tuberculosis and Lung Diseases. v.12, n.4, p.361–367, 2008.
AIMIN, H.; MINGSHI, W.; HONGYAN, H.; DECHENG, Z.; LEE, K. H. Hepatoprotective triterpenes from Sedum sarmentosum. Phytochemistry, Oxford, v. 49, n. 8, p. 2607-10, 1998.
COUTINHO, M. A. S., MUZITANO, M. F., COSTA, S. S., 2009. Flavonóides: Potenciais agentes terapêuticos para o processo inflamatório. Revista Virtual de Química 1, 241-256.
CUCCIOLONI, M., MOZZICAFREDDO, M., ONFILI, L., CECARINI, V., ELEUTERI, A.M., ANGELETTI, M., (2009): Natural occurring polyphenols as template for drug design. Focus on serine proteases. Chem Biol Drug Des., 74: 1–15.
EPAGRI − Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina. S. A. CD Plantas Medicinais. Versão 1.0. Itajaí, 1998. 1 CD-ROM.
HALIN, F.; SLOSSE, P.; HOOTELÉ, C. Sedum alkaloides – VII – Structure and synthesis of (+)-4- hydroxysedamine and (+)-4-hydroxyallosedamine. Tetrahedron, Oxford, v. 41, n. 14, p. 2891-7, 1985.
HART, H. T.; STEVENS, J. F.; JEONG, H. K. Alkaloids of some Asian Sedum species. Phytochemistry, Oxford, v. 41, n. 5, p. 1319-24, 1996.
HEIDARI-SURESHJANI M.; YAZDI F. T.; MORTAZAVI, S.A.; BEHBAHANI, B.A.; SHAHID F. Antimicrobial effects of Kelussia odoratissima extracts against food borne and food spoilage bacteria "in vitro". Journal of Paramedical Sciences, v. 5, n.2, 2015.
IBANEZ, S., GALLET, C., DESPRÉS, L., (2012): Plant Insecticidal Toxins in Ecological Networks. Toxins., 4: 228-243.
JOHANSSON, S. U., Neutrophil multitarget functional bioassay to detect anti-inflammatory natural products. J. Nat. Prod., v. 65, p. 32-41, 2002..
LEATHERBARROW, R.J. GraFit Version 5.0, Erithacus Software Ltd, Staines, U.K.,1992.
MIDDLETON, E., Kandaswami, C., Theoharides, T.C., (2000): The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease andCancer. Pharmacol Rev., 52:673-751.
MILANEZE, M. A.; GONÇALVES, E. Caracterização morfo-anatômica das folhas de Sedum dendroideum DC, CRASSULACEAE In: Simpósio Brasileiro De Farmacognosia, 3., 2001, Curitiba. Anais. Curitiba: Universidade Federal do Paraná, Departamento de Farmácia, Laboratório de Farmacognosia, 2001. p. FB-23.
OTÍN, C. L; BOND, J. S. Proteases: Multifunctional Enzymes in Life and Disease. Journal of Biological chemistry, v.283, 30433-30437, 2008.
RAWLINGS, N.D.; MORTON, F.R. The MEROPS batch BLAST: A tool to detect peptidases and their non-peptidase homologues in a genome. Биохимия, ст. 90, стр. 243-259, 2008.
SENDL, A.; MULINACCI, N.; VINCIERI, F. F.; WAGNER, H. Anti-inflammatory and immunologically active polysaccharides of Sedum telephium. Phytochemistry, Oxford, v. 34, n. 5, p. 1357-62, 1993.
SIEDLE, L.G., GUSTAVSSON, L., JOHANSSON, S., MURILLO, R., BOHLIN, L., The effect of sesquiterpene lactonas on the release of human neutrophil elastase. Biochem. Pharmacol, v. 7559, p. 1-7, 2003.
SIN, B.Y., KIM, H.P., (2005): Inhibition of collagenase by naturally-occurring flavonoids. Archives of Pharmacal Research., 28(10): 1152-1155.
STEVENS, J. F.; HART, H. T.; VAN HAM, R. C. H. J.; ELEMA, E. T.; VAN EN ENT, M. M.V.X.; WILDEBOER, M.; ZWAVING, J. H. Distribution of alkaloids and tannins in the Crassulaceae. Biochem. Syst. Ecol., Oxford, v. 23, n. 2, p. 157-65, 1995.
STUART, L.M; EZEKOWITZ, R.A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity, v. 5, p. 539-550, 2005.
THOMSON, A., KAPADIA, S.K., The Specificity of the S1 and S2 Subsites of Elastase, Eur.J.Biochem, v.102, p. 311-116, 1979.
[1] Аспирант биологических наук в IFSULDEMINAS-Campus Inconfidentes.
[2] кандидат биохимии от UNIFESP; Эффективный профессор IFSULDEMINAS-Campus Inconfidentes и адъюнкт-исследователь лаборатории биохимии Центра экологических процедур.
Представлено: май 2019 года.
Утверждено: июль 2019 года.
