ARTIGO ORIGINAL
SLEIMAN, Hanan Khaled [1], OLIVEIRA, Jeane Maria de [2]
SLEIMAN, Hanan Khaled. OLIVEIRA, Jeane Maria de. Avaliação da atividade antimicrobiana do extrato alcoólico de Equisetum arvense (cavalinha) sobre a bactéria Staphylococcus aureus. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano 05, Ed. 08, Vol. 02, pp. 78-87. Agosto de 2020. ISSN: 2448-0959, Link de acesso: https://www.nucleodoconhecimento.com.br/saude/avaliacao-da-atividade
RESUMO
A planta Equisetum arvense é conhecida popularmente como cavalinha, é originária da Europa, sendo que outras espécies do gênero Equisetum são também encontradas na América Central e do Sul, aparecendo também no Brasil, dada à proximidade geográfica. Dentre todas as espécies da planta presentes e cultivadas no Brasil, a E. arvense é a espécie mais descrita e utilizada na medicina tradicional. Esta vem sendo usada como medicamento popular há muito tempo devido as suas várias propriedades biológicas ligadas aos seus constituintes químicos. O objetivo deste trabalho foi contribuir para estudos mais detalhados da planta, averiguando sua composição química e avaliando sua atividade antimicrobiana. Para tanto o mesmo traz análises da atividade antimicrobiana de extratos de E. arvense pelo método de disco-difusão e análises de cromatografia em camada delgada revelando alguns de seus constituintes. Os resultados obtidos pelos métodos indicam que a planta possui realmente compostos que tem ação antimicrobiana sendo confirmada pela cromatografia que indica a presença de flavonoides, responsáveis pela atividade.
Palavras-chave: Extrato, atividade antimicrobiana, Equisetum arvense, Cavalinha.
1. INTRODUÇÃO
Os produtos naturais são utilizados pela humanidade desde tempos imemoriais. A busca por alívio e a cura de doenças, por meio da ingestão de ervas e folhas, talvez tenha sido uma das primeiras formas de utilização desses produtos (PEREIRA e CARDOSO, 2012). Atualmente, apesar do grande desenvolvimento da síntese orgânica e de novos processos biotecnológicos, pode-se observar um aumento notável da prática fitoterápica que foi deixada de lado com o advento da Revolução Industrial e o desenvolvimento da química orgânica (HOSTETTMANN et al., 2003; RATES, 2001).
No Brasil aproximadamente 80.000 espécies de plantas são descritas, oferecendo enorme propulsão para o descobrimento de novos fármacos. O desenvolvimento de novos fitoterápicos inclui várias etapas e envolve, atualmente, um processo interdisciplinar, multidisciplinar e interinstitucional. A pesquisa inicia-se pela busca de literatura nas áreas especificas do referido conhecimento, seguindo em paralelo a pesquisa etnobotânica, que descreve o uso popular de plantas nas diferentes culturas (POLITI, 2009).
Muitas plantas têm sido utilizadas devido às suas propriedades antimicrobianas, que estão relacionadas a compostos sintetizados no metabolismo secundário das mesmas. Dentre os compostos ativos presentes nas plantas pode-se citar os compostos fenólicos, que podem ser parte de óleos essenciais, extratos e também dos taninos. Os compostos presentes nas plantas são substâncias com estruturas químicas diferentes dos agentes antimicrobianos isolados a partir de bactérias, leveduras e fungos filamentos (POLITI, 2009; SAXENA et al., 1994).
Nesse contexto a planta Equisetum arvense, conhecida popularmente como cavalinha, é uma planta que está uniformemente distribuída pelo mundo, originária da Europa, é o único gênero não extinto da classe Equisetopsida. Não há espécie de Equisetum oficializada na Farmacopeia Brasileira, sendo descrita em outras farmacopeias na espécie Equisetum arvense. Esse táxon é amplamente utilizado em todo mundo e conhecido por suas propriedades medicinais como diurético, antianêmico, anti-inflamatório e para o tratamento de infecções do trato urinário (MELLO e BUDEL, 2015).
Tendo em vista as propriedades medicinais desta espécie e os compostos apresentados na literatura, como por exemplo, flavonoides, alcaloides, saponinas, ácidos orgânicos, acido sílico, taninos e compostos inorgânicos (CASTRO et al; RODRIGUES et al., 2011), muitos estudos estão sendo realizados em relação a atividade antimicrobiana desta planta. Vários métodos podem ser utilizados para realizar a determinação desta atividade, sendo aplicados em estudos de triagem de novas substâncias ativas como, por exemplo, a técnica de disco-difusão, onde a substancia alvo da pesquisa é colocada num reservatório (disco de papel), em contato com um meio de cultura sólido, inoculando um determinado microrganismo e após um determinado tempo afere-se o diâmetro do halo de inibição ao redor da substância em pesquisa (POLITI, 2009).
Outras análises também podem ser utilizadas a fim de se conhecer mais sobre a planta e seus compostos. Entre os métodos modernos de análise de extratos de produtos naturais, a cromatografia em camada delgada (CCD) ocupa um lugar de destaque devido a sua versatilidade em efetuar a separação e a identificação de espécies químicas em virtude da simplicidade, rapidez e sensibilidade oferecidas pela técnica (CHOZE, 2004).
Diante das propriedades medicinais desta espécie, o presente trabalho teve como objetivo realizar um estudo preliminar fitoquímico das classes de metabólitos secundários do extrato alcoólico da planta Equisetum arvense, avaliando a sua atividade antimicrobiana, através dos métodos de disco-difusão e cromatografia em camada delgada.
2. DESENVOLVIMENTO
2.1 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1.1 OBTENÇÃO DO EXTRATO DE CAVALINHA
Foram adquiridos 30g da planta seca de Equisetum arvense em uma farmácia comercial no município de Guarapuava-PR e em seguida foi preparado, em duplicata, a extração da droga vegetal com álcool absoluto (15g:250ml) por 48 horas. O material foi filtrado com peneira e executado o processo de evaporação do solvente até a obtenção do extrato no rotaevaporador Fisatom®, controlando-se a temperatura em torno de 50 ºC e com rotação de 80 – 90 rpm. Em seguida o extrato foi colocado em béqueres com o auxílio do equipamento ultra-som. O concentrado foi diluído em álcool nas concentrações de 50, 25, 10 mg/mL, para ser testado. Os discos de papel filtro foram embebidos nas soluções alcoólicas do extrato. O extrato não foi autoclavado, pois este apresenta metabólitos secundários não resistentes a altas temperaturas. Por esse motivo, o extrato foi inoculado no meio utilizado para verificação e avaliação de um possível crescimento bacteriano, o que indicaria contaminação do mesmo.
2.1.2 OBTENÇÃO DAS CEPAS DE S.AUREUS, ISOLAMENTO EM MEIO DE CULTURA E IDENTIFICAÇÃO DA ESPÉCIE
Foram obtidas cepas de S. aureus ATCC (American Type Culture Collection) isoladas (controle positivo) de um laboratório de análises clínicas do município de Guarapuava-PR, sendo estas identificadas por prova de catalase, coagulase e coloração de Gram para confirmação da espécie. Após sua identificação, foi feita uma suspensão bacteriana em solução salina estéril a 0,85% de um cultivo recente. Esta suspensão foi submetida à leitura em espectrofotômetro no comprimento de onda de 530 nm, com a absorbância final entre 0,08 – 0,1×10⁸ UFC, o que é compatível a turvação com o grau 0,5 da escala de Mac Farland. Logo a seguir, um swab estéril foi embebido no tubo preparado e então semeado no meio de cultura, suavemente em todas as direções da placa (técnica de esgotamento). Após 15 minutos de secagem, com o auxílio de uma pinça flambada e resfriada, os discos foram colocados sobre a superfície do meio inoculado, exercendo-se uma leve pressão com a ponta da pinça para melhor adesão (Laborclin).
2.1.3 PREPARO DO MEIO DE CULTURA
O ágar Müeller Hinton foi preparado conforme as instruções do fabricante, a partir de uma base desidratada disponível comercialmente, onde foram suspensos 36g do ágar em 1 litro de água destilada e aquecido até completa dissolução e em seguida foi esterilizado em autoclave a 121ºC por 15 minutos. Imediatamente após passar pela autoclave, foi resfriado em banho-maria entre 45 e 50°C. Em seguida, foi despejado o meio recém-preparado e resfriado em placas de Petri de fundo chato, em vidro, numa superfície horizontal, para garantir uma profundidade uniforme de aproximadamente 4 mm. Isso corresponde a 25-30 mL, para placas com diâmetro de 100 mm. Foi deixada uma amostra representativa das placas para confirmar sua esterilidade, mediante a sua incubação a 30-35°C, durante 24 horas. Antes da sua utilização, as placas foram retiradas da geladeira (20-30 min) para alcançarem a temperatura ambiente antes da execução dos testes (ANVISA, 2003).
2.1.4 TESTE DO HALO
A eficiência antimicrobiana do extrato da planta Equisetum arvense foi avaliada mediante teste do halo. As culturas ativas das bactérias Staphylococcus aureus foram plaqueadas em Ágar Müeller Hinton e incubadas a 35°C por 24 e 48 horas (2 placas de Petri). Para realizar o teste foram utilizados 5 discos de papel filtro que receberam alíquotas de controle positivo (antibiótico gentamicina), controle negativo (álcool) e 50, 25 e 10 mg/mL do extrato testado, e em seguida os discos foram aplicados com uma pinça estéril sobre uma placa de Petri contendo o ágar Müeller Hinton, previamente inoculada com o micro-organismo testado. Para o teste de difusão em disco foram considerados com atividade inibitória a formação de halos. Os halos de inibição do crescimento microbiano foram medidos em milímetros com auxilio de uma régua milimetrada. O teste de sensibilidade antimicrobiana pode ser definido como a resposta in vitro de um organismo a um agente antimicrobiano nas concentrações séricas ou teciduais que este agente pode alcançar quando as doses habitualmente prescritas deste agente são utilizadas. São categorizados em: Interpretação ‘Sensível’ do Teste de Sensibilidade Antimicrobiana; ‘Intermediária’ do Teste de Sensibilidade Antimicrobiana; ‘Resistente’ do Teste de Sensibilidade Antimicrobiana (ANVISA, 2003).
2.1.5 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
Foi realizada a cromatografia em camada delgada (CCD) do extrato obtido em duplicata sob diferentes concentrações, sendo utilizada a amostra A na concentração de 50 mg. A fase móvel foi composta pela fase orgânica da mistura clorofórmio: acetona (15:5) e a fase estacionária composta por placa de alumínio de gel de sílica 60F. Foi preparada a fase móvel e esta foi disposta em um béquer vedado com uma placa de Petri, em seguida um papel filtro foi colocado neste a fim de saturar a cuba. Feito isso, as amostras foram aplicadas nas placas com auxílio de um capilar. Após estarem secas, as placas foram dispostas no béquer com a fase móvel para que ocorresse a separação dos compostos presentes na planta. Em seguida as placas foram retiradas, secas novamente e reveladas com Cloreto férrico 2%, baseado na triagem fitoquímica apresentada em estudos, que indica os flavonoides (taninos) como principal classe de metabolitos secundários a ser estudado e com vapores de iodo que revela a grande maioria dos compostos orgânicos (POLITI, 2009; PERESSUTTI, 1996; ANVISA, 2010).
2.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a obtenção dos extratos, a amostra A se obteve um rendimento de 1,3598% e a amostra B um rendimento de 0,9214%.
As provas de identificação da bactéria, teste da catalase e teste de coagulase se mostraram positivas, ocorrendo formação de bolhas e formação de grumos na lâmina, respectivamente, características da bactéria em estudo.
A coloração das bactérias mostrou ao microscópio cocos Gram positivos, confirmando a espécie da bactéria, Staphylococcus aureus, conforme figura 1.
Figura 1. Cocos Gram-positivos Staphylococcus aureus
As provas em questão confirmaram que a bactéria utilizada para os testes é o Staphylococcus aureus, pois o esfregaço das colônias coradas pelo método de Gram, mostraram células redondas, roxas (Gram positivas), isoladas aos pares e agrupadas, formando cachos. O diagnóstico confirmatório foi dado pelas provas de catalase, que para a família Microccocacea (estafilococos) a prova geralmente é positiva, e a prova de coagulase, onde esta é positiva quando há a formação de qualquer coágulo, indicando a presença de S. aureus (CODEIRO, 2011).
Para o teste do halo, duas placas contendo ágar com a semeadura, receberam os discos e ao final do tempo de incubação, os extratos mostraram atividade antimicrobiana frente ao S. aureus formando halos ao redor do disco, como pode ser observado na figura 2.
Figura 2. Halos formados nas placas, contendo a semeadura e os discos impregnados com: antibiótico gentamicina como controle positivo (CP), extratos nas concentrações 10, 25 e 50 mg/mL e álcool como controle negativo (CN)
Os diâmetros das amostras foram medidos e se apresentam na tabela 1.
Tabela 1. Diâmetros de inibição das amostras nas placas A e B contendo:antibiótico gentamicina como controle positivo (CP), extratos nas concentrações 10, 25 e 50 mg/mL e do álcool como controle negativo (CN)
A inibição do crescimento bacteriano pelo extrato vegetal pode ter várias explicações, como por exemplo, as ações do conjunto de metabólitos secundários presentes na planta. Compostos fenólicos como taninos podem ser tóxicos para microrganismos devido à inativação de enzimas e proteínas transportadoras da parede celular. Enquanto os flavonoides podem se complexar com proteínas extracelulares e interferir na expressão de genes. Já os flavonoides lipofílicos podem romper a membrana plasmática microbiana (ALENCAR, 2014).
Além das análises citadas, para comprovar que o extrato da planta cavalinha realmente possui compostos que apresentam atividade antimicrobiana, foi realizada a cromatografia em camada delgada, buscando os compostos fenólicos, que apresentam essa ação, conforme figura 3.
Figura 3. Cromatoplacas reveladas com cloreto férrico apresentando bandas referentes a compostos fenólicos.
As placas reveladas com o reagente cloreto férrico específico para a detecção de compostos fenólicos apresentaram banda de coloração verde, confirmando a presença desses compostos na planta (SIMÕES et al., 2017). O metabolismo secundário das plantas pode oferecer diversos compostos bioativos muito utilizados na medicina popular há centenas de anos. Dentre as ações farmacológicas encontradas em extratos de plantas, pode-se citar os mecanismos antimicrobianos e os antifúngicos, onde os terpenoides e os compostos fenólicos são os principais responsáveis por esta atividade. Estudos ainda relatam que bactérias como o Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumonia apresentaram sensibilidade frente aos taninos que são compostos fenólicos (WERMUTH, 2015).
2. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Diante dos resultados obtidos, pode-se concluir que a planta Equisetum arvense (Cavalinha), apresentou atividade antimicrobiana sobre a bactéria em estudo. A formação de halos de inibição na análise microbiológica mostrou que mesmo o extrato não estando em grandes concentrações, inibiu o crescimento das bactérias. A análise cromatográfica possibilitou confirmar a presença de compostos fenólicos o que confirma a atividade antimicrobiana, já que estes são os principais metabólitos secundários responsáveis pela ação farmacológica.
Sugere-se novos estudos com concentrações mais altas dos extratos testados, principalmente para análise e determinação das concentrações inibitórias mínimas – para os micro-organismos e o limite de tolerância – para seres humanos, identificando as doses terapêuticas adequadas.
REFERÊNCIAS
ALENCAR, L. C. B. Avaliação da atividade antimicrobiana de plantas medicinais do gênero Spondias. Universidade Estadual da Paraíba. Centro de Ciências Biológicas e da Saúde. Coordenação de Farmácia. Campina Grande-PB, 2014.
ANVISA. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Norma Aprovada – M2-A8, vol.23, nº1, Janeiro 2003. Disponível em: < http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/clsi/clsi_opasm2-a8.pdf > Acesso em: 14/09/2017.
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Farmacopeia Brasileira, Volume 1, 5ª edição. Brasília, 2010. Disponível em: < http://www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/pdf/volume1.pdf > Acesso em: 18/10/2017.
CASTRO, V. C.; OLIVEIRA, J. R.; VILELA, P. G. F.; CARVALHO, C. A. T.; ROCHA, R. F.; JORGE, A. O. C.; OLIVEIRA, L. D. Efeito microbicida do extrato glicólico de Equisetum arvense L. (cavalinha) sobre Staphylococcus spp., Streptococcus mutans e Candida spp. Universidade Estadual Paulista – UNESP / Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal, Laboratório de Microbiologia e Imunologia.
CHOZE, R. Técnicas de separação e identificação empregadas na análise de produtos naturais de plantas. Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Físicas e matemáticas. Departamento de Química. Florianópolis, novembro de 2004.
CORDEIRO, M. M. Caracterização molecular de cepas de Staphylococcus aureus isoladas no Hospital Municipal de Ipatinga-MG. Universidade Federal de Ouro Preto. Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Ouro Preto- MG, 2011.
HOSTETTMANN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. Princípios ativos de plantas superiores. São Carlos: EdUFSCar, 2003. p.9, 60-61.
LABORCLIN. Disponível em: < file:///C:/Users/Admin/Desktop/TCC/coagulase.pdf > Acesso em: 22/08/2017.
MELLO, M.; BUDEL, J. M.; Equisetum L. (Equisetaceae): Uma revisão. UNIBRASIL, Faculdades Integradas do Brasil. Cadernos da Escola Saúde, Curitiba, 9: 1-15.
PEREIRA, R. J.; CARDOSO, M. G. Metabólitos secundários vegetais e benefícios antioxidantes. Journal of Biotechnology and Biodiversity. Vol. 3, N. 4: pp. 146-152, November 2012.
PERESSUTTI, G. E. Biopolímeros da Família Arecaceae: Archontophoenix cf. cunninghamiana e Butia eriospatha. Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Departamento de Bioquímica. Curitiba- PR, 1996.
POLITI, F. A. S. Estudos farmacognósticos e avaliação de atividades biológicas de extratos obtidos das cascas pulverizadas de Endopleura uchi (Huber) cuatrec. (Humiriaceae). Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Araraquara – SP, 2009.
RATES, S. M. K. Promoção do uso racional de fitoterápicos: uma abordagem no ensino de farmacognosia. Rev. Bras. Farmacog., v.11, p.57-69, 2001b.
RODRIGUES, C.; SANTOS, A. G.; GARCIA, B. H.; SILVA, A. L. B. R.; CORTEZ, L. E. R. Avaliação preliminar fitoquímica da espécie Equisetum arvense (cavalinha). VII EPCC- Encontro Internacinal de Produção Científica. CESUMAR- Centro Universitário de Maringá. Maringá- Paraná- Brasil, 2011.
SAXENA, G.; MCCUTCHEON, A. R.; FARMER, S.; TOWERS, G. H. N.; HANCOCK, R. E. W. Antimicrobial constituents of Rhus glabra. J. Ethnopharmacol., v.42, p.95-99, 1994.
SIMÕES, C. M. O; SCHENKEL, E. P.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. Farmacognosia: do produto natural ao medicamento. Porto Alegre: Artmed, 2017.
WERMUTH, D. Compostos fenólicos e atividade antibacteriana de extratos de folhas de jambeiro vermelho (Syzygium malaccense). Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Especialização em Gestão da Qualidade na Tecnologia de Alimentos. Monografia de Especialização, Francisco Beltrão, 2015.
[1] Doutoranda – PPGCF – UNICENTRO – PR; Mestre em Ciências Farmacêuticas – PPGCF – UNICENTRO – PR; Farmacêutica – UNICENTRO – PR.
[2] Doutoranda – PPGCF – UNICENTRO – PR; Mestre em Ciências Farmacêuticas – PPGCF – UNICENTRO – PR; Farmacêutica – UNIGUAIRACÁ – PR.
Enviado: Julho, 2020.
Aprovado: Agosto, 2020.
