ARTIGO ORIGINAL
BANDEIRA, Debora Marina [1], MARCHI, Juliana Pelissari [2], GOMES, Simone Damasceno [3], PELLIZZARO, Luciana [4]
BANDEIRA, Debora Marina. et al. Atividade antimicrobiana da Curcuma longa L. sobre Escherichia coli. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano. 08, Ed. 04, Vol. 03, pp. 05-16. Abril de 2023. ISSN: 2448-0959, Link de acesso: https://www.nucleodoconhecimento.com.br/biologia/atividade-antimicrobiana, DOI: 10.32749/nucleodoconhecimento.com.br/biologia/atividade-antimicrobiana
RESUMO
Curcuma longa é uma planta que tem se destacado em pesquisas que avaliam atividade antimicrobiana, antinflamatória, antiprotozoária, anticarcinogênica e antifúngica. A descoberta de novas alternativas para desenvolvimento de fármacos com origem em princípios ativos de plantas se faz necessária considerando a alta capacidade adaptativa dos diferentes microrganismos. Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos da oleoresina e da suspensão de pó de rizomas de Curcuma longa frente à bactéria Escherichia coli. Neste estudo, não foi observada atividade antimicrobiana para os extratos da cúrcuma em pó e da oleoresina frente à Escherichia coli. Verifica-se na literatura uma grande variedade de resultados obtidos frente a testes com C. longa sobre os diferentes microrganismos, sendo alguns positivos, demonstrando ação antimicrobiana, e outros negativos. Essa divergência se justifica por fatores como: diferentes metodologias utilizadas, clima, tipos de solo, adubação, disponibilidade hídrica do cultivo da planta, bem como a forma de colheita e armazenamento, os quais interferem nos componentes presentes e em sua concentração na planta. Embora os resultados deste estudo tenham sido negativos, não significa que a planta não possua atividade antimicrobiana, sendo indicada a continuidade nos ensaios, visando identificar os fatores que geram discordância entre os estudos já realizados.
Palavras-chave: Produtos naturais, Óleo resina, Pó de cúrcuma, Curcumina, Atividade antimicrobiana.
1. INTRODUÇÃO
Produtos naturais têm sido utilizados ao longo da História no tratamento e prevenção de doenças. Atualmente, eles vêm ganhando grande importância nas pesquisas para a elaboração de fármacos de origem natural. Vários grupos de pesquisadores têm estudado a atividade biológica de plantas medicinais originárias de diversas partes do mundo, guiados pelo uso popular das espécies nativas (SILVA FILHO et al., 2009; SANTOS et al., 2021; BANDEIRA et al., 2022).
Uma planta que, além de ser utilizada na culinária, tem estado presente nas pesquisas das áreas farmacológicas é Curcuma longa L., conhecida popularmente por açafrão ou cúrcuma. É uma planta herbácea, pertence à família Zingiberaceae, nativa do sudeste asiático, mais precisamente das florestas tropicais da Índia, país de maior produção mundial (PEREIRA; STRINGHETA, 1998; FRANCO et al., 2007; SABIR et al., 2021).
A parte do vegetal com maior utilização é o rizoma, no qual são encontradas as substâncias responsáveis pelo seu valor mercadológico e ação terapêutica (COLLINO, 2014). São três os pigmentos curcuminoides presentes no rizoma: a curcumina (principal composto responsável pelas várias atividades da planta), a desmetoxicurcumina e a bisdesmetoxicurcumina (SILVA FILHO et al., 2009; SABIR et al., 2021). Pereira e Stringheta (1998), explicam que a cúrcuma possui três produtos disponíveis comercialmente: o pó de cúrcuma, a oleoresina de cúrcuma e o extrato de curcumina.
Pesquisas com C. longa comprovaram sua atividade antimicrobiana (MAIA et al., 2003; KALAYCIOGLU et al., 2017), antinflamatória, antioxidante, antiprotozoária, anticarcinogênica e antifúngica (AKRAM et al., 2010; MARCHI et al., 2016). Frente à resistência que os microrganismos patogênicos têm desenvolvido, surge a necessidade e o incentivo pela procura de fármacos de origem natural (BANDEIRA et al., 2022).
A bactéria E. coli, por exemplo, é um microrganismo comensal, presente no intestino de mamíferos e aves, que tem sido apontado como um dos agentes bacterianos mais frequentes em diarreias de seres humanos e animais, podendo ocasionar, em seres humanos, diversas infecções, incluindo a meningite (FERREIRA; KNÖBL, 2009; ALMEIDA, 2013).
A alta capacidade adaptativa dos microrganismos torna a pesquisa sobre o seu comportamento essencial para a saúde pública. A Organização Mundial da Saúde (OMS), divulgou recentemente a primeira lista de “agentes patogênicos prioritários” resistentes a antibióticos, com 12 famílias de bactérias que representam a maior ameaça para a saúde humana. Nesta lista, destaca-se, em particular, a ameaça de bactérias gram-negativas, resistentes a múltiplos antibióticos, como é o caso da E. coli, que junto a outras Enterobacteriaceae, estão na lista como prioridade 1, ou seja, “crítica, resistente a carbapenema e cefalosporinas de terceira geração, os melhores antibióticos disponíveis para tratamento de bactérias multirresistentes” (OMS, 2018). Além disso, a E. coli apresenta entre 8% e 65% (variável entre diferentes países) de resistência à ciprofloxacina, um antibiótico comumente usado para tratar infecções do trato urinário (OMS, 2017).
Assim, faz-se necessária a descoberta de novas alternativas para o desenvolvimento de fármacos com origem nos princípios ativos de algumas plantas. Neste contexto, este estudo objetivou avaliar a atividade antimicrobiana do extrato da oleoresina e da suspensão de pó de rizomas de C. longa sobre a bactéria E. coli, tendo em vista serem produtos já à disposição dos consumidores.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi realizado no Laboratório de Microbiologia da Universidade Paranaense, Unidade Universitária de Francisco Beltrão, sendo a parte experimental realizada de maio a outubro de 2018.
Os rizomas de Curcuma longa foram adquiridos no comércio de Francisco Beltrão, Paraná. Foram lavados, higienizados em água corrente, descascados, fatiados na espessura de aproximadamente 0,5 cm. Após isto, as fatias foram secas em estufa a 50 ºC, até a verificação de massa constante. O período total de secagem foi de aproximadamente um mês. O peso de massa constante foi de 516,63 g.
Após a secagem, o pó foi obtido pela trituração dos rizomas em liquidificador doméstico, seguido de peneiramento por quatro malhas de diferentes espessuras. O pó foi acondicionado em sacos plásticos duplos (uma camada de papel kraft e outra de saco plástico, até sua utilização) e mantido em ambiente seco (MARCHI, 2018).
O pó do rizoma de cúrcuma foi dividido em: 180 g para ser feito o extrato alcoólico para a obtenção da oleoresina (OR); e 173,24 g para obtenção da suspensão do pó (SP).
Para obtenção da OR, iniciou-se fazendo um extrato bruto (EB), sendo utilizado o processo de maceração com álcool etílico a 70% em temperatura ambiente (PEREIRA; STRINGHETA, 1998; RODRIGUES et al., 2016). Foram usados 180 g de pó de cúrcuma para 540 ml de álcool 70% (1:3 (m/v) de planta/solvente); o material foi homogeneizado com auxílio de bastão de vidro, envasado em recipiente de vidro envolvido por papel alumínio, etiquetado para identificação (nome, data, hora) e armazenado em local escuro por 15 dias, com agitação diária.
Decorridos quinze dias, o EB foi filtrado a vácuo. Para isso, um funil de Buchner foi acoplado a um kitassato com borracha, para completa vedação, e do kitassato seguiu uma mangueira até a bomba de vácuo. Após a montagem do equipamento, o funil recebeu dois papéis filtro na forma de círculo, no qual foi depositado o EB. Em seguida, o aparelho foi ligado e ocorreu a sucção do EB pela bomba, permitindo a sua filtração. O filtrado foi direcionado para o interior do kitassato, obtendo-se a tintura, contendo álcool, totalizando 350 ml. O material sólido que ficou retido no papel filtro foi posteriormente descartado (MARCHI, 2018).
A tintura obtida foi colocada em rotaevaporador para remoção do álcool etílico. Para tanto, a tintura foi colocada em balão de fundo chato, que foi conectado ao rotaevaporador e aquecido em banho-maria a uma temperatura de 45 + 5 ºC.
O procedimento foi realizado até que 1/5 da tintura estivesse no balão, sendo, a partir de então, denominada OR (20%). O material foi acondicionado em tubos de falcon, envolvidos em papel alumínio e armazenados em refrigerador até a diluição para a montagem do experimento (MARCHI, 2018).
Com relação à OR, o preparo puro obtido após a rotaevaporação foi considerado como 100% e está diluído nas concentrações de 50; 25; 12,5 e 6,25%, em Tween 80 (a 0,1%). Para preparo da suspensão do pó a 20%, foi feita a adição de 1,875 g de pó em 7,5 ml de uma solução estéril de Tween 80 (0,1%), conforme metodologia usada por Dornellas (2016).
Cepas de Escherichia coli foram adquiridas e reconstituídas de acordo com a indicação do fornecedor. As culturas microbianas foram padronizadas em 108 células/ml, estimadas por comparação ao tubo 0,5 da escala McFarland.
Para o ensaio, adotou-se o Método de Difusão por Plugue de Ágar, adaptado de Kurtzman Jr (1973) e Harris e Ruger (1953), que consiste em remover um pedaço do meio de cultura do local correspondente ao repique após o período de incubação e colocá-los na superfície do meio de cultura inoculado com o material a ser testado, onde, após isso, se observará a inibição de crescimento em função da difusão do produto a ser testado e/ou do antibiótico a partir do plugue. Assim, foram utilizadas placas de Petri de 100 x 20 mm de diâmetro, nas quais foram acrescentados 20,0 ml de ágar Muller Hinton preparados conforme a indicação na embalagem. Após serem homogeneizadas e deixadas em repouso até a solidificação, com um swab estéril, foi inoculada a cultura de E. coli, uniformemente, sobre a superfície do ágar as placas, que foram deixadas em repouso em temperatura ambiente, por aproximadamente três minutos.
Paralelamente, foram preparadas das placas contendo 15,0 ml de meio esterilizado, mais 5,0 ml de suspensão em pó ou OR previamente diluídos em suas concentrações (3:1 meio/extrato). A mistura foi homogeneizada e se aguardou a solidificação. Depois, foram removidos os plugues (recortes) cilíndricos de cada uma dessas placas para o meio contendo o inóculo. Em cada placa foram transferidos cinco plugues em suas devidas concentrações – da maior para menor de OR (100%, 50; 25; 12,5 e 6,25%) – bem como plugues com controle positivo – utilizando amoxicilina e cloranfenicol, e com controle negativo, utilizando Tween 80 a 0,1%.
O experimento foi realizado em quintuplicata e as placas incubadas à temperatura 40 + 3 ºC, por 24 horas (MARTINS, 2010; MINAGAWA, 2007).
Para a análise da SP, seguiu-se o mesmo procedimento, porém adicionando às placas com meio de cultura e inócuo, plugues contendo a SP a 20%, nas mesmas concentrações da OR (100; 50; 25; 12,5 e 6,25%).
Após o intervalo de 24 horas, a mensuração dos halos de inibição, quando formados, foi realizada com paquímetro, de acordo com os critérios preconizados pelo National Committe for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2003).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste estudo, não foi observada atividade antimicrobiana para os extratos da suspensão do pó da cúrcuma (SP) e da oleoresina (OR) frente à bactéria Escherichia coli, em nenhuma das concentrações testadas. (Figura 1).
Figura 1: Comparação de presença ou não de halos de inibição
Essa não inibição da E. coli por produtos da cúrcuma foi testada em outros estudos. Péret-Almeida (2006), por exemplo, avaliou a atividade antimicrobiana da cúrcuma em pó, dos pigmentos curcuminoides e do óleo essencial de cúrcuma. Nesse experimento, apenas o óleo essencial teve atividade antimicrobiana sobre E. coli, Bacillus subitilis, Salmonella enterica Choleraesuis, Aspergillus niger e Saccharomyces cereviseae. O mesmo foi observado nos estudos de Norajit et al. (2007), Araújo et al. (2015) e Franco et al. (2007), os quais também testaram produtos da cúrcuma e não houve atividade contra a E. coli. A não ação da C. longa contra E. coli pode ser justificada por peculiaridades próprias da bactéria ou da planta.
Quanto à E. coli, assim como outras bactérias, acredita-se que o potencial patogênico e resistente de algumas cepas se deve a ganhos genéticos ocorridos durante o processo evolutivo da espécie, devido à aquisição de genes de virulência, por meio de mutações ou transferência horizontal de material genético, que as fez desenvolver mecanismos complexos de resistência (VIEIRA, 2009). Estes genes de virulência, provenientes de materiais genéticos extracromossômicos (plasmídeos), codificam proteínas que possibilitam colonização, penetração e invasão de novos espaços por algumas bactérias (CORRÊA, 2012), dificultando o controle.
Da mesma forma, a atividade antimicrobiana para bactérias gram negativas é menor quando exposta a alguns antimicrobianos, associando esse fato à presença da membrana externa na estrutura das bactérias, o que pode restringir a penetração de determinadas substâncias (SINGH et al., 2002; GUL et al., 2004).
Embora isso, curcumina livre – pigmento presente na cúrcuma – e microcristais de curcumina apresentaram atividade antimicrobiana sobre E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa (SANTOS, 2015; DORNELLAS, 2016). A curcumina também foi efetiva em outro estudo, contra bactérias gram negativas, como E. coli e S. chorelaesuis (TAKEUCHI, 2012). O extrato etanólico e o óleo essencial da C. longa também agiram contra cepas padrões e isolados clínicos de E. coli, tendo o extrato etanólico provocado maior inibição em comparação ao óleo (ÀLVAREZ et al., 2016).
Neste contexto, é possível perceber que o extrato etanólico e a curcumina foram mais efetivos contra E. coli. Isso pode ser explicado pela concentração de curcumina que varia nos rizomas de uma planta para outra, pois Pereira e Stringheta (1998) apontaram uma concentração média de curcumina de 2,5% e, Chassagnez; Corrêa e Meireles (1997), de 6,4%. A diferença de concentração frequentemente está associada à composição dos rizomas ou à forma como é extraída.
Assim, a espécie de cúrcuma aqui avaliada pode ter apresentado baixa concentração de curcumina, influenciando na não atividade antimicrobiana. Tendo em vista que não foi feita a análise fitoquímica para C. longa usada neste ensaio, não se pode confirmar essa hipótese. Com relação à utilização da OR, tem-se o intuito de concentrar os compostos curcuminoides em relação ao rizoma da planta moída em pó, pois elimina o amido presente em maior quantidade no rizoma (25 a 50 %) (NAGHETINI, 2006; SABIR et al., 2021). Assim, há possibilidade de que a OR seja mais efetiva na sua ação antimicrobiana, porém neste estudo isto não se confirmou.
Vários são os fatores que podem influenciar na concentração de componentes ativos nos produtos da cúrcuma. A temperatura de extração e o tamanho das partículas apresentam influência significativa no rendimento da extração de curcumina com etanol, conforme estudo realizado por Peron et al. (2010) com OR de cúrcuma. A temperatura de secagem a 70 ºC favoreceu a extração de OR, bem como contribuiu para a manutenção de curcumina na matéria-prima (CHASSAGNEZ; CORRÊA e MEIRELES, 1997). A temperatura de secagem e rotaevaporação da OR deste estudo variou de 40ºC a 50ºC, o que pode ter influenciado nas concentrações de curcumina, porém essa possibilidade só poderia ser comprovada, mais uma vez, mediante análises fitoquímicas.
As condições de solo e de cultivo também interferem no teor de curcumina dos rizomas. Peron et al. (2010), comprovaram existir diferença significativa de 95% entre os rizomas cultivados em Piracicaba comparados aos rizomas cultivados em Monte Alegre do Sul, ambas cidades paulistas.
Além disso, há o método de extração utilizado, que interfere nas diferenças físico-químicas dos produtos das plantas. Naghetini (2006), observou que a extração com hexano foi mais simples, rápida e de rendimento maior quando comparada com a hidrodestilação. Já Pereira e Stringheta (1998), afirmam que álcool etílico e acetona são indicados como bons solventes, sendo a acetona o solvente mais utilizado, mesmo apresentando alguns problemas de inflamabilidade e alto custo para sua recuperação, a fim de livrar o produto da sua presença.
Um estudo feito por Krishnamurthy et al. (1976), sobre processos de extração dos curcuminoides com acetona, etanol e dicloro etileno, concluíram que a acetona se apresentou mais eficiente do que o etanol e o dicloro etileno, fornecendo um produto contendo 42% de curcuminoides. Indicando, assim, que o etanol, solvente utilizado nesse estudo, possa não ser tão eficaz na extração dos compostos necessários para a ação antimicrobiana.
4. CONCLUSÃO
Os extratos em pó e OR produzidos a partir de Curcuma longa comercializados em Francisco Beltrão, Paraná, não apresentaram atividade antimicrobiana para cepas de Escherichia coli.
Este resultado pode estar atrelado a diversos fatores, como: a possível resistência da bactéria aos compostos da planta ou as condições ambientais e de manejo, como: temperatura, tipo de solo, adubação, disponibilidade hídrica, época de colheita e tempo de armazenamento, que podem influenciar na composição química e na concentração de componentes da SP e da OR, que foram efetivos em outros estudos, como a curcumina.
Sugere-se uma continuidade nos ensaios, visando identificar qual ou quais são os fatores que causam discordâncias com a literatura, bem como a análise dos componentes presentes nos produtos testados.
5. AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Universidade Paranaense, pelo ambiente de estudo proporcionado; a professora Orientadora Luciana Pellizzaro, por todo tempo investido na realização deste trabalho; a professora Coorientadora, Juliana Pelissari Marchi, pela experiência no assunto e auxílio na realização deste trabalho; e a professora Simone pelo incentivo em publicar meu trabalho.
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[2] Mestra em Plantas Medicinais e Fitoterápicos na Atenção Básica. ORCID: 0000-0002-7779-0253. Currículo Lattes: http://lattes.cnpq.br/3593944907268063.
[3] Doutora em Agronomia. ORCID: 0000-0001-7639-8500. CURRÍCULO LATTES: http://lattes.cnpq.br/3362104483832351.
[4] Orientadora. Mestre em Ciências Ambientais. ORCID: 0000-0003-1701-9763. CURRÍCULO LATTES: http://lattes.cnpq.br/9146011936057512.
Enviado: 23 de Fevereiro, 2023.
Aprovado: 10 de Março, 2023.
