ARTIGO ORIGINAL
PINTO, Cayuan Tadeu Brandão [1], MEIRELES, Luciana Regina [2]
PINTO, Cayuan Tadeu Brandão. MEIRELES, Luciana Regina. Modelos de cultivo in vitro de Toxoplasma gondii. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano. 11, Ed. 04, Vol. 01, pp. 56-91. Abril de 2026. ISSN: 2448-0959. Disponível em: https://www.nucleodoconhecimento.com.br/biologia/cultivo-in-vitro, DOI: 10.32749/nucleodoconhecimento.com.br/biologia/cultivo-in-vitro
Sistemas de cultivo in vitro de Toxoplasma gondii são extremamente importantes porque fornecem taquizoítos ativos, viáveis e com alto grau de pureza. Várias linhagens celulares e métodos de cultivo têm sido propostos, porém não há um consenso na literatura especializada sobre o modelo mais adequado para produção in vitro de T. gondii. Neste estudo, foram avaliadas duas linhagens celulares (LLCMK2 e VERO), provenientes de tecido epitelial renal de mamíferos e dois meios de cultura com diferentes composições e concentrações de nutrientes (DMEM e RPMI-1640) a fim de obter uma fonte consistente de parasitas com máximo rendimento e viabilidade. Para inóculo inicial dos cultivos foi padronizada como ideal a relação célula-parasita (1:4), independentemente da linhagem celular e meio de cultivo utilizados. Todas as culturas foram suplementadas com 10% de soro fetal bovino e mantidas em estufa a 37ºC com atmosfera de 5% de CO2. O rendimento e a viabilidade dos taquizoítos foram avaliados por microscopia convencional em câmara de Neubauer após coloração com azul de tripano e por citometria de fluxo utilizando o sistema Muse®. Culturas com células VERO resultaram um maior rendimento de parasitas, cerca de três vezes mais quando comparadas às culturas com células LLCMK2. Cultivos em meio DMEM e RPMI – 1640 apresentaram parâmetros semelhantes de rendimento e viabilidade de taquizoítos, independentemente da linhagem celular utilizada, mostrando que não houve interferência da composição dos meios no crescimento in vitro de T. gondii. Nossos modelos de cultivo in vitro resultaram em porcentagem de viabilidade de taquizoítos superior a 90%, tanto por microscopia convencional como por citometria de fluxo. Os parâmetros de rendimento e viabilidade de taquizoítos de T. gondii foram viáveis nas três primeiras passagens, com rendimento em torno de 4×107 parasitas. Este estudo otimizou com sucesso modelos de cultivo in vitro de taquizoítos de T. gondii que produziram parasitas com alto rendimento, pureza e viabilidade, fornecendo subsídios para o aprimoramento da rotina de laboratórios de cultivo celular.
Palavras-chave: Toxoplasma gondii, Células VERO, Células LLCMK2, Meio DMEM, Meio RPMI -1640.
Nas últimas décadas a cultura de células eucariotas tornou-se um recurso valioso tanto para a pesquisa clínica como para a área de biotecnologia industrial. Células mantidas em cultura constituem modelos biológicos mais simples e baratos se comparados à experimentação animal e fornecem dados suficientemente informativos para estudos funcionais, bioquímicos e moleculares, inclusive para análise de alvos farmacológicos e produção de produtos biológicos, como vacinas e anticorpos (Hudu et al., 2016). As técnicas de cultivo de parasitas representam um segmento substancial do estudo das parasitoses de importância médica, especialmente aquelas causadas por protozoários (Ahmed, 2014). O sucesso no estabelecimento in vitro de cultura de parasitas não só permite que sua fisiologia, comportamento e metabolismo sejam estudados dinamicamente, mas também, que a natureza das moléculas antigênicas dos produtos excretados e secretados por esses agentes seja vigorosamente pesquisada e analisada (Ahmed, 2014; Hudu et al., 2016). Este entendimento tem sido extremamente importante, pois fornece informações sobre o desenvolvimento do parasita, bem como caminhos para novas abordagens para o diagnóstico, gestão, controle e prevenção de doenças parasitárias humanas. Cabe ressaltar que a cultura in vitro de protozoários deve envolver procedimentos cuidadosamente padronizados, visto que estes parasitas apresentam ciclos de vida complexos com diferentes fases morfológicas e espécies hospedeiras, podendo estes ter animais homeotérmicos ou pecilotérmicos como hospedeiros intermediários ou definitivos dentro dos seus ciclo de vida, exigindo diferentes parâmetros de cultivo, como nutrientes, temperatura e mesmo condições de incubação, como é o caso do agente Toxoplasma gondii, causador da toxoplasmose (Visvesvara, Garcia, 2002).
Com a crescente demanda por métodos de produção de taquizoítos de T. gondii de forma mais simples e econômica, os sistemas de cultivo in vitro de T. gondii têm sido propostos como métodos alternativos ao uso de modelos animais não só por questões éticas questionáveis, mas também pela falta de infraestrutura dos biotérios e profissionais especializados na maioria dos centros de pesquisa. Além disso, o crescimento de taquizoítos em cultura celular é um procedimento mais econômico, com um custo que varia de um terço a metade daquele despendido com modelos animais (Harmer et al., 1996; Evans et al., 1999; Chatterton et al., 2002. Vale ressaltar que o cultivo in vitro de T. gondii é vantajoso para estudos que requerem um método que seja livre da ação de mecanismos imunes efetores e células do hospedeiro (Chatterton et al., 2002). Em cultivo celular, os taquizoítos de T. gondii replicam-se intracelularmente com um tempo de geração de 6 – 9 horas, aumentando em número de 64 – 128 parasitas por célula. Após este período, a célula hospedeira se rompe e os parasitas livres infectam células vizinhas, proporcionando alto rendimento de parasitas (Radke; White, 1998; Saadatnia et al., 2010).
O cultivo in vitro de T. gondii é extremamente valioso por inúmeras razões como (i) auxiliar o diagnóstico clínico por permitir o isolamento do agente; (ii) produzir antígenos para preparo de anticorpos monoclonais e policlonais que serão utilizados como reagentes em ensaios sorológicos; (iii) identificar proteínas específicas que podem aumentar as propriedades invasoras do parasita e, por sua vez, o desenvolvimento de anticorpos monoclonais que ajudarão a neutralizar a invasão parasitária; (iv) avaliar anticorpos funcionais e sistemas de proteção mediados por células do hospedeiro contra o parasita, avaliações essas que só podem ser feitas de uma forma rentável utilizando cultura in vitro; (v) rastrear fármacos, in vitro, a fim de identificar potenciais agentes terapêuticos; (vi) diferenciar os isolados sensíveis de resistentes para que possam ser feitos progressos na quimioterapia; (vii) diferenciar isolados clínicos; (viii) auxiliar no desenvolvimento de vacinas, uma vez que a cultura contínua durante longos períodos de tempo pode causar atenuação de uma cepa com potencial para aplicação em vacinas; (ix) fornece um sistema para avaliar a eficácia da vacina, já que este procedimento envolve a utilização de parasitas viáveis que podem ser obtidos em grandes quantidades in vitro sem as influências dos componentes do hospedeiro (Chatterton et al., 2002; Visvesvara; garcia 2002; Değirmenci et al., 2011; Ahmed, 2014).
Uma variedade de linhagens celulares e métodos de cultivo têm sido utilizados para o crescimento in vitro de T. gondii nos últimos anos (de Meerschman et al., 2002), porém o investimento nesta área ainda é restrito, sendo raros os trabalhos que utilizam esta ferramenta para produção em massa de antígenos.
No presente estudo, propusemos avaliar modelos de cultivo in vitro para isolamento e crescimento de taquizoítos da cepa RH de T. gondii, a fim de obter uma fonte consistente de parasitas de boa qualidade e com o mínimo de contaminação por células hospedeiras. Os ensaios foram avaliados em duas linhagens celulares (LLCMK2 e VERO), provenientes de tecido epitelial renal de mamíferos e em dois meios de cultura com diferentes composições e concentrações de nutrientes (DMEM e RPMI-1640). A porcentagem de taquizoítos viáveis e a contaminação de células hospedeiras foram determinadas microscopicamente em câmara de Neubauer e por citometria de fluxo utilizando o sistema Muse® (Merck Millipore).
Para obtenção de taquizoítos da cepa RH foram utilizados 10 camundongos Swiss não isogênicos, fornecidos pelo Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Os animais foram mantidos no biotério de experimentação do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMTSP) em capelas ventiladas com ar estéril e ventilação forçada, alojados em gaiolas de plástico contendo maravalha de pinho autoclavada. A manipulação dos animais foi conduzida de acordo com as diretrizes do Conselho Nacional de Experimentação Animal – CONCEA com aprovação prévia pela CEUA IMTSP (protocolo nº 345A).
Suspensões de taquizoítos da cepa RH de T. gondii, registrada na ATCC sob nº 50174 foram obtidas por meio de sucessivas passagens com intervalos de 3 a 4 dias, em camundongos Swiss não isogênicos pesando em torno de 20 g. Os animais previamente infectados foram submetidos à eutanásia pela administração intraperitoneal de tiopental (150-200mg/Kg) e o peritônio lavado com 5 mL de solução salina tamponada com fosfato 0,01M pH 7,2 (PBS). Após quantificação em câmera de Neubauer, os parasitas foram diluídos apropriadamente em PBS, e cada animal recebeu 107 taquizoítos por inoculo intraperitoneal.
Foram utilizadas duas linhagens de células aderentes provenientes de tecido epitelial renal de mamíferos, a saber: LLCMK2, derivada de rim de macaco Rhesus (Macaca mulatta), registrada na ATCC sob nº CCL-7 e VERO, derivada de rim de macaco – verde africano (Cercopithecus aethiops), registrada na ATCC sob nº CCL- 81. Estas células foram obtidas do biorrepositório do Laboratório de Protozoologia do IMTSP, onde são conservadas em nitrogênio líquido e mantidas por cultivos periódicos. Como se trata de linhagens provenientes de tecido epitelial renal, as células são aderentes e necessitam de adesão a uma superfície de contato para que possam iniciar a sua proliferação. Assim, o cultivo destas linhagens foi realizado em garrafas plásticas de cultura de 75 cm2 (Corning®) que permitiram a adesão das células por meio de receptores específicos da matriz extracelular. Em cultura, essas células se espalham por todo o fundo da garrafa formando uma monocamada celular.
Os cultivos de T. gondii foram realizados em dois meios de cultura com diferentes composições e concentrações de nutrientes (meio de Eagle modificado por Dulbeco – DMEM – D5648 – Sigma® e meio RPMI – 1640 – Sigma®). A composição de cada um dos meios de cultivo está detalhada no quadro 1. Os meios foram suplementados, ainda, com 100mg/L de glutamina; 50mg/L de hipoxantina, 110 mg/L de piruvato de sódio e 1mL/L de insulina humana a fim de fornecerem todos os nutrientes necessários para o crescimento de T. gondii.
Para evitar o risco de contaminação, os meios de cultivo foram mantidos com antibióticos (Penicilina 100U/mL e Estreptomicina 0,1 mg/mL) e antifúngico (Anfotericina B 2,5μg/mL).
Quadro 1: Descrição da composição do meio DMEM utilizado no cultivo de T.gondii
| DMEM Marca: Sigma Código: D5648 | Descrição | Quantidades (mg/mL) |
| Sais inorgânicos | Cloreto de cálcio (anidro) Nitrato Férrico. 9H2O Sulfato de magnésio (anidro) Cloreto de Potássio Cloreto de sódio Fosfato de sódio monobásico (anidro) Glicose Vermelho de Fenol Na | 200 0,1 97,67 400 6400 109 4500 15,9 |
| Aminoácidos | L-Arginina HCl L-Cistina 2HCl L-Glutamina Glicina L-Histidina HCl H2O L-Isoleucina L-Leucina L-Lisina HCl L-Metionina L-Fenilalanina L-Serina L-Treonina L-Triptofano L-Tirosina 2Na 2H2O L-Valina | 0.084 0.0626 0.584 0.03 0.042 0.105 0.105 0.146 0.03 0.066 0.042 0.095 0.016 0.10379 0.094 |
| Vitaminas | Cloreto de colina Ácido Fólico Mio-Inositol Niacinamida Ácido D-Pantotênico hemicálcica Piridoxal HCl Riboflavina Tiamina HCl | 0.004 0.004 0.0072 0.004 0.004 0.004 0.0004 0.004 |
Fonte: Dados obtidos da ficha técnica dos meios de cultura fornecidos pelo fabricante – Sigma® (2016).
Quadro2: Descrição da composição do meio RPMI – 1640 utilizado no cultivo de T.gondii
| RPMI 1640 Marca: INLAB Código: IR 6300 | Descrição | Quantidades (mg/mL) |
| Sais inorgânicos | CaCl2 2H2O KCl MgSO4 (anidro) NaCl Na2HPO4 (anidro) | 200,00 400,00 48,83 6000,00 800,49 |
| Aminoácidos | L-Arginina HCl L-Asparagina L-Ácido Aspártico L-Ácido Glutâmico L-Cistina 2HCl L-Glutamina L-Histidina HCl 2H2O Hidróxido L-Prolina L-Isoleucina L-Leucina L-Lisina HCl L-Metionina L-Fenilalanina L-Treonina L-Triptofano L-Tirosina (Na2) 2H2O L-Valina Glicina L-Prolina L-Serina | 241,86 50,00 20,00 20,00 65,19 300,00 20,27 20,00 50,00 50,00 40,00 15,00 15,00 20,00 5,00 28,83 20,00 10,00 20,00 30,00 |
| Vitaminas | Biotina Colina de cloreto Ácido fólico L-Inositol Nicotinamida Pantotenato de Cálcio Ac. P-aminobenzóico Piridoxal HCl Riboflavina Tiamina HCl Vitamina B12 | 0,20 3,00 1,00 3,50 1,00 0,25 1,00 1,00 0,20 1,00 0,005 |
| Outros componentes | Tampão Hepes Vermelho de Fenol (Na) Guanina | 25,00mM 5,10 2000,00 |
Fonte: Dados obtidos da ficha técnica dos meios de cultura fornecidos pelo fabricante – Sigma® (2016).
Taquizoítos da cepa RH de T. gondii foram cultivados em meio DMEM ou RPMI – 1640, utilizando as linhagens celulares LLCMK2 e VERO como células hospedeiras. Essas linhagens foram cultivadas individualmente em cada um dos meios e mantidas em garrafas plásticas estéreis (Corning®) em estufa com 5% de CO2 a 37°C. Todos os cultivos foram mantidos com 10% de soro fetal bovino e os repiques foram realizados a cada 72 hs para evitar a confluência total da monocamada celular e consequentemente danos celulares devido à escassez de nutrientes do meio, eventualmente, consumidos pelo crescimento celular excessivo. Isto permitiu a padronização de uma rotina de trabalho, na qual eram realizados dois repiques semanais para cada linhagem celular. Os repiques foram realizados com concentrações padronizadas de células que foram quantificadas pelo contador de células automático portátil digital Scepter™ 2.0 (Merck Millipore). Para tal, garrafas de 25cm2 contendo culturas de LLCMK2 ou VERO foram tratadas com 5 mL de ATV e as células que se desprenderem do fundo da garrafa foram ressuspendidas em meio DMEM ou RPMI contendo 10% de soro fetal. Em seguida, foi retirada uma alíquota de 500 μL que foi submetida à quantificação pelo contador automático Scepter™ 2.0. Após quantificação, a suspensão celular foi ajustada para uma concentração final de 25×104 células/mL de meio contendo 10% de soro fetal bovino e elas foram cultivadas em garrafas de 25 cm2 em estufa com 5% de CO2 a 37°C.
O cultivo de T. gondii foi realizado pela inoculação de taquizoítos da cepa RH em culturas de LLCMK2 e VERO. Previamente à inoculação, foi realizado o repique das linhagens celulares com quantidade padronizada de células e estas culturas foram mantidas em estufa com 5% de CO2 a 37°C por 24 horas. Após este período, foi realizado o lavado peritoneal de camundongos inoculados com a cepa RH, como descrito no item 2.1, e os taquizoítos obtidos foram inoculados em concentrações padronizadas nas culturas de LLCMK2 e VERO e os cultivos foram mantidos nas condições descritas anteriormente. As culturas foram observadas diariamente e após 72hs, quando a monocamada celular se encontrava rompida e a maioria dos taquizoítos estavam livres, o meio foi retirado da garrafa e os parasitas foram recuperados por centrifugação a 2500 rpm por 10 minutos a 4°C. A quantificação destes parasitas foi realizada por microscopia em câmara de Neubauer, sendo que algumas amostras foram quantificadas também por citometria de fluxo utilizando o sistema Muse® (Merck Millipore).
Para avaliação da concentração ideal de células hospedeiras para o cultivo de T. gondii foram realizados ensaios em placas de poliestireno contendo 24 poços (Corning®) que receberam concentrações de 105, 104, 103 e 102 células hospedeiras (LLCMK2 ou VERO) por mL de meio (DMEM ou RPMI – 1640). As placas foram mantidas em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO2 e foram observadas (aumento de 32X) em microscópio invertido (Leitz, LABOVERT®) após 24hs de cultivo para avaliação da concentração ideal de células hospedeiras por campo, levando-se em consideração que esta concentração não deve ser tão alta ao ponto de as células ficarem sobrepostas, prejudicando a invasão e o crescimento dos parasitas e nem tão baixa, impedindo a manutenção e sobrevivência dos mesmos em cultura. Assim, verificou-se que a quantidade máxima por campo (aumento de 32X) seria 30 células, correspondendo a aproximadamente 20.000 células/poço. As imagens dos campos analisados no microscópio invertido estão presentes na figura 1, onde é possível observar que na concentração de 104 células/mL, o número de células por campo é o ideal, já que em concentrações inferiores (103 e 102 células/mL), as quantidades de células por campo são muito baixas e na concentração de 105 células/mL as mesmas estão sobrepostas. A partir desta padronização, os ensaios subsequentes foram realizados com concentrações em torno de 104 células.
Figura 1: Ensaio em placa de 24 poços para padronização da concentração ideal de células VERO por campo. A: 105 células por poço; B: 104 células por poço; C: 103 células por poço e D: 102 células por poço
Após a determinação da concentração ideal de células hospedeiras para o cultivo de T. gondii, foi avaliada a relação célula – parasita, visando o melhor rendimento final de parasitas in vitro. Para determinação desta relação, foram realizados ensaios em placas de cultura de 24 poços (Corning®) que receberam concentrações padronizadas de células e parasitas para obtenção de relações que variaram de 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 e 1:32. Inicialmente, as placas receberam as concentrações de 8×104; 4×104; 2×104, 104, 0,5×104 e 0,25×104 células/mL. Todas as concentrações foram ensaiadas em quadruplicatas e as placas foram mantidas em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO2. Após 24 hs, foram adicionados 8×104 taquizoítos por poço, correspondendo às relações célula-parasita supracitadas.
Os cultivos foram observados (aumento de 20X) em microscópio invertido (Leitz, LABOVERT®) nos períodos de 24 hs, 48 hs e 72 hs. Após 72 hs, retirou-se uma alíquota de cada poço e o rendimento final de parasitas foi determinado por quantificação em câmara de Neubauer, sendo que algumas amostras foram quantificadas também por citometria de fluxo, utilizando o sistema Muse® (Merck Millipore) como descrito no item 2.3.7.2. Considerou-se como relação ideal aquela em que foi observado o melhor rendimento final de parasitas. O rendimento final dos parasitas foi calculado pela fórmula abaixo:
Após determinação da relação célula – parasita para manutenção in vitro de T. gondii em ensaios realizados em placas de 24 poços, os cultivos foram mantidos em garrafas de 25 cm2 (Corning®), calculando-se a concentração de células e parasitas na garrafa a partir da extrapolação dos dados obtidos nos ensaios em placas. Assim, a partir da determinação da concentração ideal de células por poço (área de 2cm2) foi calculada a concentração equivalente de células para a garrafa (área de 25cm2). Baseado neste cálculo, os cultivos em garrafas de 25 cm2 foram realizados com inoculo inicial de 25 x 104 células e 106 taquizoítos.
A porcentagem de taquizoítos viáveis foi determinada por microscopia em câmara de Neubauer após coloração da suspensão parasitária com Azul de Tripano. Como este corante não atravessa membranas íntegras, as células vivas não são coradas, ocorrendo fluxo de corante somente para o interior de células mortas, já que apresentam suas membranas danificadas.
Aleatoriamente, amostras de taquizoítos foram avaliadas também por citometria de fluxo, utilizando o sistema Muse® (Merck Millipore), que consiste em um citômetro de bancada compacto, automático e portátil com detecção fluorescente e tecnologia microcapilar para análise quantitativa e de viabilidade celular, podendo ser aplicado tanto para células aderentes como em suspensão que apresentem 2 a 60μm de diâmetro. O equipamento é capaz de computar entre 10 e 500 partículas/μL de amostra, o que corresponde a 104 e 5×105 partículas por mL. A citometria foi proposta neste estudo com o intuito de avaliar sua eficiência como método alternativo à microscopia usual em câmara de Neubauer, já que é considerada altamente sensível e precisa.
Antes de serem submetidas à citometria, as amostras de taquizoítos foram previamente diluídas em duas soluções distintas de PBS com azida sódica 0,02%, contendo como fluorocromos, acridina orange (5μg/mL), que apresenta alta sensibilidade, e iodeto de propídeo (0,5 μg/mL), altamente específico. Tubos eppendorfs contendo 380 μL de cada uma destas soluções receberam 20 μL de amostra de taquizoítos, resultando em diluição 1/20 do material. Após diluição, as amostras foram mantidas a temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, foram aplicadas no sistema Muse®. Todas as contagens foram padronizadas para 1000 eventos, utilizando-se a diluição 1/20 em volume final de 1 mL. Eventualmente, as amostras que ultrapassaram o limite de detecção foram diluídas 1/200 e novamente submetidas ao sistema.
Após padronização do sistema de cultivo in vitro de T. gondii, avaliou-se o rendimento final de parasitas em relação ao número de passagens do cultivo celular. Para tal, foram realizados repiques semanais em garrafas de 25 cm2 (Corning®) com acompanhamento periódico das culturas em microscópio óptico invertido. Após 72 hs, o rendimento final de parasitas foi determinado por quantificação de taquizoítos em câmara de Neubauer ou citometria de fluxo como descrito no item anterior.
A comparação dos valores individuais entre os grupos foi realizada por ANOVA com pós-teste de Bonferroni. Diferenças significativas foram consideradas quando a probabilidade de igualdade foi menor que 0,05 (p <0,05). Todas as análises foram realizadas no programa estatístico GraphPad 8.0.
Para avaliação da relação ideal célula – parasita para cultivo de T. gondii foram realizados ensaios em placas de 24 poços utilizando as linhagens celulares LLCMK2 e VERO, cultivadas em DMEM ou RPMI, de acordo com a metodologia descrita no item 2.3.6. Na figura 2 podemos observar que as relações célula – parasita 1:4 e 1:8 resultaram em maiores quantidades de parasitas (figura 2A), proporcionando um maior rendimento destes parasitas (figura 2B) quando comparadas às demais relações avaliadas em culturas realizadas com a linhagem LLCMK2 em meio DMEM. Contudo, não houve diferença estatística entre estas duas relações.
Figura 2: Resultados dos cultivos celulares de LLCMK2 em meio DMEM. A: Número de parasitas totais obtidos para cada relação célula – parasita testada. B: Rendimento final de parasitas para cada relação célula – parasita avaliada. ***p<0,001 ANOVA
A figura 3 mostra imagens de cultivos de taquizoítos da cepa RH de T. gondi em células LLCMK2 com diferentes relações célula – parasita. Como podemos observar na figura 3B e figura 3C, as relações 1:4 e 1:8 resultaram em maior rendimento de parasitas, corroborando com os resultados descritos acima.
Figura 3: Proliferação de taquizoítos da cepa RH de T. gondii em cultivos com LLCMK2 em diferentes relações célula – parasita (aumento 32X). A: relação 1:1; B: relação 1:2; C: relação 1:4; D: relação 1:8; E: relação 1:16 e F: relação 1:32
Nas culturas realizadas com células VERO em meio DMEM, observamos resultados semelhantes aos descritos anteriormente para células LLCMK2, porém, neste caso, houve diferença estatística significante entre as relações 1:4 e 1:8 (p<0,01), com rendimento maior de parasitas para a relação 1:8 (figura 4).
Figura 4: Resultados dos cultivos celulares de VERO em meio DMEM. A: Número de parasitas totais obtidos para cada relação célula – parasita testada. B Rendimento final de parasitas para cada relação célula – parasita avaliada. ** p<0,01 ANOVA
A figura 5 apresenta imagens de cultivos de taquizoítos da cepa RH de T. gondii em células VERO com diferentes relações célula – parasita. Como podemos observar na figura 5C, a relação 1:8 resultou em maior rendimento de parasitas.
Figura 5: Proliferação de taquizoítos da cepa RH de T. gondii em cultivos com células VERO em diferentes relações célula – parasita (aumento 32X). A: relação 1:1; B: relação 1:2; C: relação 1:4; D: relação 1:8; E: relação 1:16 e F: relação 1:32
Em relação às culturas com o meio RPMI, nossos dados foram semelhantes aos descritos para os cultivos em meio DMEM. A figura 6 mostra que as relações célula – parasita 1:4 e 1:8 resultaram em maiores quantidades de parasitas (Fig.6A), proporcionando um maior rendimento destes parasitas (Fig.6B) quando comparadas às demais relações avaliadas em culturas realizadas com a linhagem LLCMK2. Nas culturas realizadas com células VERO, observamos resultados semelhantes, porém com diferença estatística significante entre as relações 1:4 e 1:8 (p<0,01), com rendimento maior de parasitas para a relação 1:8 (figura 7), semelhante aos resultados obtidos com o meio DMEM.
Figura 6: Resultados dos cultivos celulares de LLCMK2 em meio RPMI. A: Número de parasitas totais obtidos para cada relação célula – parasita testada. B: Rendimento final de parasitas para cada relação célula – parasita avaliada. **p<0,01 ANOVA
Figura 7: Resultados dos cultivos celulares de VERO em meio RPMI. A: Número de parasitas totais obtidos para cada relação célula – parasita testada. B: Rendimento final de parasitas para cada relação célula – parasita avaliada. ** p<0,01 ANOVA
Interessante notar que não houve diferença em relação ao rendimento de parasitas para cultivos realizados com o meio DMEM e o meio RPMI, demonstrando que, embora com composições diferentes, ambos os meios proporcionaram rendimento semelhante de T. gondii em culturas com LLCMK2 (figura 8A) e com VERO (figura 8B).
Figura 8: Comparação dos resultados dos cultivos de T. gondii com os meios DMEM e RPMI. A: Cultivos com células LLCMK2. B: Cultivos com células VERO
Em relação à linhagem celular, podemos observar na Fig. 9 que as células VERO proporcionaram maior rendimento de parasitas quando comparadas às células LLCMK2 (p<0.001), tanto em cultivos com meio DMEM, como naqueles com meio RPMI. O rendimento de parasitas nas relações 1:4 e 1:8 foi aproximadamente três vezes maior em cultivos com células VERO quando comparado aos resultados dos cultivos com células LLCMK2.
Figura 9: Comparação dos resultados dos cultivos de T. gondii com as células LLCMK2 e VERO. A: Cultivos com o meio DMEM. B: Cultivos com o meio RPMI. *** p<0,001 ANOVA
Diante desses resultados, optamos por utilizar nos ensaios subsequentes a relação célula – parasita 1:4, pois esta relação apresentou resultados semelhantes para ambas as linhagens celulares testadas, independentemente do meio utilizado. Assim, uma vez padronizada a concentração ideal célula – parasita em ensaios em placas de 24 poços (Corning®), os cultivos de T. gondii passaram a ser realizados em garrafas de 25cm2 (Corning®), de acordo com a metodologia descrita no item 2.3.6, visando à obtenção de uma maior quantidade de parasitas para ensaios de viabilidade, bem como rendimento de taquizoítos em relação ao número de passagens do cultivo celular. Para tal, foram realizados cultivos celulares com inoculo inicial de 106 parasitas, sendo que após 72hs, determinou-se o rendimento final destes parasitas no cultivo celular.
Na Fig.10 podemos observar que o rendimento dos parasitas após 72 hs de cultivo em garrafas plásticas de 25cm2 foi maior para as culturas realizadas com células VERO (p<0,001), resultando em um rendimento final de 3×107 parasitas, enquanto o rendimento final para as culturas com células LLCMK2 foi de 107 parasitas.
Figura 10: Rendimento de taquizoítos de T. gondii após 72 hs de cultivo em garrafas com células LLCMK2 e células VERO. *** p<0,001 ANOVA
A viabilidade de taquizoítos de T. gondii foi determinada por microscopia em câmara de Neubauer e por citometria de fluxo com o sistema Muse®, de acordo com a metodologia descrita no item 2.3.7.
A figura 11 apresenta os resultados de viabilidade dos taquizoítos de T. gondii que obtivemos em nossos cultivos, independentemente, da linhagem celular e meio utilizado. Esta imagem foi obtida por microscopia convencional (aumento de 40x), mostrando uma porcentagem de viabilidade de taquizoítos em torno de 90%, com um mínimo de contaminação por células hospedeiras. Em todos os ensaios de viabilidade, utilizamos um controle contendo taquizoítos de T. gondii formolizados para avaliarmos a qualidade e atividade do corante azul de Tripan, já que, nestas condições, os parasitas devem estar corados em azul pela impregnação do corante devido à fragmentação de suas membranas (figura 11B).
Figura 11: Coloração de taquizoítos da cepa RH de T. gondii com Azul de Tripan. A: parasitas vivos; B: parasitas mortos
A citometria foi proposta neste estudo com o intuito de avaliar sua eficiência como método alternativo à microscopia usual em câmara de Neubauer, já que é considerada altamente sensível e precisa. Contudo, como dispúnhamos de uma quantidade restrita de reagentes e fluoróforos para citometria, selecionamos aleatoriamente algumas amostras que já haviam sido avaliadas com azul de tripano por microscopia em câmara de Neubauer e ensaiamos estas amostras no sistema Muse®. Nessa etapa, optamos por trabalhar com as células da linhagem VERO mantidas no meio DMEM. Na figura 12 podemos observar que a viabilidade dos parasitas determinada pelo sistema Muse® foi de 83,4%, semelhante à observada na microscopia com azul de tripano.
Figura 12: Viabilidade dos parasitas produzidos em cultivo em células VERO mantidas no meio DMEM por Citometria de fluxo microcapilar (Muse® Millipore)
Após padronização dos métodos de cultivo in vitro de T. gondii e da determinação da viabilidade dos taquizoítos, procuramos avaliar o rendimento final de taquizoítos em relação ao número de passagens do cultivo celular, porém tivemos um problema de contaminação da sala de cultura e dos cultivos que impediu a avaliação em tempo hábil de vários repiques sequenciais das culturas. Nessa etapa, continuamos a trabalhar com as células VERO mantidas no meio DMEM. Na figura 13 podemos observar que o rendimento dos parasitas foi semelhante até o terceiro repique das culturas, atingindo um rendimento final em torno de 4×107 parasitas, porém no quarto repique tivemos uma queda acentuada deste rendimento. Ao analisarmos a viabilidade dos parasitas pelo sistema Muse®, observamos uma queda na porcentagem de taquizoítos viáveis, com aproximadamente 50% de taquizoítos mortos (figura 14). Este fato poderia ser atribuído ao tempo de cultivo dos parasitas utilizados nos repiques. Em nossos ensaios, utilizamos taquizoítos com 72hs de cultivo. Nestas condições, os parasitas já poderiam estar sofrendo estresse pela influência da saturação do meio. Talvez, se tivéssemos utilizado taquizoítos com 48hs de cultivo tivéssemos obtido um rendimento final melhor.
Figura 13: Rendimento de parasitas em relação ao número de passagens em garrafas de 25 cm² contendo VERO mantidas no meio DMEM
Figura 14: Resultados do sistema Muse® para viabilidade dos parasitas obtidos após quatro passagens em cultura contendo células VERO mantidas no meio DMEM
Nos últimos anos vários laboratórios passaram a utilizar sistemas de cultivo in vitro para manutenção e produção de taquizoítos viáveis de Toxoplasma gondii, agente causador da toxoplasmose (Ashburn et al., 2000, Chatterton et al., 2002; Buddhirongawatr et al., 2006; da Costa-silva, 2012 e Ahmed, 2014), visando, sobretudo, a produção de antígenos para ensaios sorológicos (Evans et al., 1999; Ashburn et al.,2000 e Hemphill et al., 2004).
O cultivo in vitro tem sido proposto também como método alternativo ao uso de modelos animais já que por muito tempo a linhagem RH de T. gondii foi mantida por passagens sucessivas em camundongos para produção em massa de antígeno bruto do parasita (Ware, Kasper 1987; Colombo et al., 2005, Ferreira- da-silva et al., 2009; Lynch et al., 2009). Ensaios in vivo apresentam algumas desvantagens, pois são onerosos, necessitam de biotérios e profissionais especializados, além de serem eticamente questionáveis.
Neste trabalho, avaliamos de forma simultânea duas linhagens celulares (VERO e LLCMK2), provenientes de tecido epitelial renal de macacos. As células VERO são muito utilizadas na produção de vacinas virais humanas e como matriz de suporte para crescimento de células aderentes em biorreatores (Frazatti-Gallina et al., 2004). Além disso, existem inúmeros trabalhos na literatura que utilizam essa linhagem para estudos voltados para otimização de cultivo in vitro de T. gondii (Sivrikaya, Bağriaçik 2011; da Costa-silva et al., 2012; Cuéllar et al., 2012). As células LLCMK2 foram utilizadas inicialmente para a propagação do vírus da poliomielite para produção de vacina humana, porém na década de 60 foi descoberto no interior dessas células a presença do vírus vacuolante símio 40 (SV40) que inevitavelmente teve correlação com a incidência de câncer em pessoas vacinadas naquela época (Engels, 2005). Atualmente essa linhagem vem sendo muito utilizada em estudos voltados para a parte terapêutica e fisiológica de T. gondii (da Silva et al., 2015; Magno et al., 2005; Dantas-leite et al., 2004).
Nossos resultados mostraram que as culturas com células VERO proporcionaram maior rendimento de taquizoítos quando comparado com as células LLCMK2 após 72 horas de cultivo. Estes dados corroboram com estudos anteriores que demonstraram que as células VERO constituem um bom modelo celular para o crescimento e produção de taquizoítos de T. gondii (Saadatnia et al., 2010; de Meerschman et al., 2002; da Costa-silva et al., 2012).
Além da linhagem celular é necessário otimizar o meio de cultura que será empregado nos modelos de cultivo in vitro. Atualmente, existem inúmeros tipos de meios de cultivo disponíveis no mercado voltados para sistemas in vitro de T. gondii. Entretanto, há certa escassez de trabalhos na literatura que os comparem, mesmo tendo em vista que muitos destes meios possuem diferentes compostos em suas formulações que poderiam influenciar no crescimento e rendimento do parasita in vitro.
É imprescindível proporcionar um microambiente adequado para células mantidas em cultura, fornecendo substâncias e nutrientes essenciais para seu desenvolvimento. No presente estudo, optamos em trabalhar com dois meios de cultura (DMEM e RPMI – 1640) que apresentam diferentes concentrações de nutrientes em suas composições e que são amplamente utilizados em sistemas de cultivo de células. Nossos dados mostraram que não houve interferência do meio de cultivo no rendimento e viabilidade dos taquizoítos em sistemas de cultivo de T. gondii utilizando células LLCMK2 e VERO.
Uma das diferenças mais significativas entre ambos é que o meio RPMI-1640 possui uma concentração de fosfato muito maior do que o meio DMEM, equivalente a 5.0 mM e 1 mM, respectivamente. Por outro lado, o meio RMPI-1640 apresenta uma concentração de cálcio menor do que o meio DMEM, o equivalente a 0.8 mM e 1.8 mM, respectivamente (Wu et al., 2009). Já em relação à glicose, o meio DMEM possui uma concentração superior ao meio RMPI-1640 (4,5 g/L comparado com 2 g/L) (Saadatnia et al., 2010). Não se sabe ao certo quais componentes podem influenciar o cultivo, porém existem alguns estudos que tentam elucidar a função dessas substâncias, principalmente a importância que o cálcio e a glicose exercem dentro do sistema de cultura, uma vez que já foi demonstrado que meios de cultivo diferentes podem intervir na proliferação e na viabilidade celular (Liu et al., 2009; Li et al., 2007; WU et al., 2009). Contudo, ainda há contradições a respeito da influência do cálcio nesse contexto. Alguns estudos demonstram que concentrações elevadas de cálcio estão intimamente relacionadas com a proliferação celular (Maeno et al., 2005; Lopez-Cazuax et al., 2006), todavia, um estudo realizado por Wu et al. (2009), comparando os meios DMEM e RPMI-1640 no comportamento biológico de células derivadas do periósteo de cães, demonstrou que não houve diferença estatística significativa em relação à proliferação celular pelo ensaio de MTT em relação ao cálcio. Além disso, neste mesmo estudo, a glicose também foi avaliada com intuito de observar o crescimento celular, e por mais que se saiba que o meio DMEM apresente o dobro deste componente quando comparado com o meio RPMI – 1640, não foi possível observar diferenças significativas nesta questão, corroborando com o nosso trabalho.
Por outro lado, Saadatnia et al. (2010) demonstraram que o meio DMEM proporcionou melhor rendimento de taquizoítos viáveis em comparação ao meio RPMI-1640, provavelmente, pelo fato do meio DMEM apresentar uma concentração maior de glicose quando comparado ao meio RPMI, já que essa substância é de suma importância para a fisiologia da célula, além de ser o principal nutriente utilizado pelos taquizoítos de T. gondii na elaboração de diversas macromoléculas indispensáveis para sua sobrevida, como trifosfato de adenosina (ATP), lipídios, proteínas e ácidos nucléicos (Nitzsche et al., 2016).
Ao determinarmos os parâmetros de rendimento e viabilidade dos taquizoítos de T. gondii por microscopia, em câmara de Neubauer, após coloração com azul de tripano, optamos também por avaliar estes parâmetros por citometria de fluxo microcapilar, utilizando o sistema Muse® que é altamente sensível. Os resultados obtidos na citometria pelo sistema Muse® corroboraram com aqueles obtidos pela câmara de Neubauer, sugerindo que futuramente este método possa ser aplicado como método de rotina, já que é bastante preciso e mais rápido do que a quantificação em câmara de Neubauer e analisadores automatizados baseados em imagens. Em nosso estudo também obtivemos uma porcentagem superior a 90% de viabilidade dos taquizoítos produzidos in vitro, com mínimo de contaminação de células hospedeiras, corroborando com os resultados obtidos por Saadatnia et al. (2010) que descreveram 99% de viabilidade e 3% de contaminação com células hospedeiras.
Em relação ao número de passagens, infelizmente, pudemos avaliar apenas quatro repiques sequenciais de T. gondii nos cultivos celulares, pois tivemos problemas de contaminação na sala de cultura durante nossos experimentos, o que inviabilizou, em tempo hábil, a avaliação do rendimento de parasitas frente a inúmeras passagens. Contudo, observamos que o rendimento dos taquizoítos se manteve viável e constante até a terceira passagem, com 4×107 parasitas, porém ao realizarmos a quarta passagem, obtivemos uma queda acentuada, tanto no rendimento como da viabilidade destes parasitas.
Ao analisarmos a viabilidade dos taquizoítos por citometria pelo sistema Muse®, verificamos uma alta proporção de parasitas mortos, indicando que talvez em ensaios futuros seja necessário um tempo menor de cultivo entre os repiques. Assim, ao invés de utilizarmos parasitas com 72 horas de cultivo, iremos utilizar parasitas com no máximo 48 horas de cultivo, pois neste caso os taquizoítos apresentam maior viabilidade, facilitando seu processo de invasão na célula hospedeira.
A otimização do método de repique das culturas é um fator extremamente importante para o sucesso da manutenção de T. gondii in vitro por longos períodos e, certamente, será um dos focos de nossos estudos futuros. De Costa-Silva et al., (2012) demonstraram que taquizoítos de T. gondii cultivados em células VERO em meio isento de soro mantiveram suas capacidades imunogênicas e antigênicas após 30 passagens in vitro.
Neste estudo, avaliamos modelos de cultivo in vitro de T. gondii utilizando taquizoítos da cepa RH, pertencente ao genótipo I, mas futuramente pretendemos aplicar estes modelos para cepas do tipo II e tipo III. Os resultados advindos do nosso estudo foram bastante promissores fornecendo subsídios que poderão contribuir para o aprimoramento da rotina de laboratórios de cultivo celular, visando melhor rendimento, pureza e viabilidade dos parasitas produzidos in vitro.
A partir desse estudo foi possível otimizar modelos de cultivo in vitro de Toxoplasma gondii, estabelecendo parâmetros de rendimento e viabilidade promissores e factíveis para o crescimento e isolamento de taquizoítos em cultura celular, onde (i) os parâmetros de rendimento e viabilidade de taquizoítos de T. gondii foram melhores nos cultivos realizados com células VERO; (ii) cultivos de T. gondii com DMEM e RPMI–1640 apresentaram resultados semelhantes de rendimento e viabilidade de parasitas, independentemente, da linhagem celular utilizada; (iii) A relação célula-parasita (1:4) apresentou melhores resultados como inoculo inicial para cultivos in vitro de T. gondii utilizando diferentes meios de cultura e linhagens celulares; (iv) Os resultados de viabilidade dos taquizoítos por microscopia convencional com coloração pelo Azul de Tripano e por citometria de fluxo foram semelhantes, apresentando porcentagem superior a 90%, com mínima contaminação por células hospedeiras, em todos os modelos in vitro propostos; (v) Os parâmetros de rendimento e viabilidade de taquizoítos de T. gondii foram viáveis nas três primeiras passagens com rendimento em torno de 4×107 parasitas, decaindo após a quarta passagem, porém não foi possível avaliar, em tempo hábil, quantidades maiores de repiques devido a problemas técnicos de contaminação dos cultivos. Este estudo foi bastante promissor, uma vez que avaliou de forma simultânea duas linhagens celulares e dois meios de cultura para otimização de cultivos in vitro de T. gondii, fornecendo subsídios que poderão contribuir para o aprimoramento da rotina de laboratórios de cultivo celular, visando melhor rendimento, pureza e viabilidade dos parasitas produzidos in vitro.
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[1] Mestre em Ciências pelo Programa de Medicina Tropical na área de Doenças Tropicais e Saúde Internacional pelo Instituto de Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (2022). Especialização lato sensu em Microbiologia Clínica pelo Instituto de Pesquisa e Ensino de Saúde de São Paulo (2022); Especialização lato sensu em Epidemiologia Multiprofissional pelas Práticas dos SUS pela Universidade Nove de Julho (2021) e Especialização lato sensu em Protozoologia em Saúde Pública pela Escola de Educação Permanente do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (2017). Possui graduação em Biomedicina pela Universidade Nove de Julho (2015) e Licenciatura em Ciências Biológicas pelo Instituto de Educação e Qualificação Profissional (Resolução 2/97) (2018). ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0590-5856. Currículo Lattes: http://lattes.cnpq.br/2809485419531739.
[2] Orientadora. Doutora em Ciências pelo Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (2005); Mestre em Ciências pelo Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (2001); Especialista em Zoonoses e Saúde Pública pelo Programa lato sensu de Residência em Medicina Veterinária pela Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista (1999), Campus de Botucatu e Médica Veterinária pela Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (1997). ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0913-1579. Currículo Lattes: http://lattes.cnpq.br/3886900774786977.
Contribuição dos autores:
Cayuan Tadeu Brandão Pinto: Análise, interpretação e redação do trabalho.
Luciana Regina Meireles: Concepção, planejamento, análise, interpretação e redação do trabalho.
Conflito de interesse:
Não há conflito de interesse.
Agradecimentos e Financiamento:
Agradecemos o Laboratório de Investigação Médica em Protozoologia, Bacteriologia e Resistência antimicrobiana (LIM 49) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo pelo fornecimento dos meios de cultura, e à FUNDAP pelo financiamento da bolsa de Aprimoramento Profissional de Cayuan Tadeu Brandão Pinto.
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Histórico da Publicação:
Material recebido: 28 de agosto de 2024.
Material aprovado pelos pares: 21 de fevereiro de 2025.
Material editado aprovado pelos autores: 12 de dezembro de 2025.
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