Avaliação da Atividade Antibacteriana e Antifúngica do Óleo Essencial de Frutas Cítricas

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RODRIGUES, Amanda Sabino [1], SILVA, Michelli Aparecida Bertolazo da [2]

RODRIGUES, Amanda Sabino; SILVA, Michelli Aparecida Bertolazo da. Avaliação da Atividade Antibacteriana e Antifúngica do Óleo Essencial de Frutas Cítricas. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. Ano 03, Ed. 06, Vol. 03, pp. 106-118, Junho de 2018. ISSN:2448-0959

Resumo

Os óleos essenciais de frutas cítricas representam uma classe importante de substâncias químicas secretadas pelos vegetais, apresentando vários benefícios para saúde humana Plantas que detém atividade antimicrobiana geram grande interesse nos profissionais da Biotecnologia, pois, muitos microrganismos apresentam resistência aos antibióticos já existentes. Neste contexto, a comprovação de atividade biológica em extratos possibilita o desenvolvimento de novos produtos. Objetivou-se neste trabalho avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica dos óleos essenciais de limão Tahiti (Citrus aurantifolia) e laranja Pera (Citrus sinesis) frente aos microrganismos Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990) Candida albicans (ATCC 289065). O método utilizado para a extração dos óleos essenciais foi destilação por arraste a vapor, utilizando os solventes hexano e diclorometano para separação das frações. A avaliação dos resultados foi realizada através da medida do diâmetro do halo de inibição nas placas de cultivo frente a discos embebidos com 10 µl de cada fração. Os resultados para ambos mostram-se promissores, sendo necessária a realização de novas avaliações para confirmação da eficácia do produto.

Palavras-chave: Óleo Essencial, Laranja Pera, Limão Tahiti, Atividade Antibacteriana, Atividade Antifúngica.

1. Introdução

A produção brasileira de laranja e limão na safra de 2013, segundo o IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, foi de 18,5 milhões de toneladas. A maior parte da produção encontra-se no estado de São Paulo com destino a produção de suco, a qual gera uma quantidade considerável de resíduos industriais. A preocupação com o meio ambiente tem motivado os pesquisadores a encontrarem uma utilidade aos resíduos industriais, pois estes, depois de gerados, necessitam de um destino adequado para não gerar impactos ambientais, prejudicando a biodiversidade. Diante disso, há um interesse crescente da Biotecnologia em estudos propondo usos alternativos para os resíduos agroindustriais biologicamente ativos, os reaproveitando e agregando valor a substâncias que seriam descartadas. O desenvolvimento de projetos que utilizem resíduos industriais, especialmente no desenvolvimento de novos fármacos, alimentos, geração de energia e prevenção da poluição ambiental são de grande valia para o desenvolvimento sustentável (PELIZER et al, 2007; REZZADORI et al., 2009; SCHENBERG, 2010).

O número de casos de infecções bacterianas e fúngicas, bem como a resistência adquirida por esses microrganismos frente aos antimicrobianos tem chamado atenção da comunidade e de pesquisadores. Nesse contexto, a pesquisa de novas substâncias ativas no controle de infecções se faz extremamente necessária. Se considerarmos que novas espécies de plantas são descobertas com frequência, estima-se que apenas 1% da abrangência da biodiversidade existente tem sido utilizada. Sendo assim, ainda parecem existir muitas fontes para serem exploradas em busca de novos antibióticos e antifúngicos (CAUMO et al, 2010).

Diante do exposto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar preliminarmente a atividade antibacteriana e antifúngica do óleo essencial da casca da Laranja Pera (Citrus sinesis) e de Limão Tahiti (Citrus aurantifolia), visando o desenvolvimento futuro de um produto com atividade antimicrobiana.

2. Material e métodos

Para realização dos experimentos foram obtidas Laranjas Pêra (Citrus sinesis) e Limões Thaiti (Citrus aurantifolia) prontos para o consumo em uma Central de Abastecimento do Paraná S/A – CEASA/PR.

2.1 Extrações óleo essencial Laranja Pera

A extração do óleo essencial de laranja Pêra foi realizada conforme a metodologia de Trancoso (2013): inicialmente, isolou-se a parte do flavedo (parte externa da casca) que foram picadas em um diâmetro de 4 mm utilizando 128 gramas de casca para cada extração. Foram realizadas três extrações com Laranja Pera. O método utilizado foi a hidrodestilação em aparelho de Clevenger (destilação por arraste a vapor) com adição de 500 ml de água destilada com duração de cinco horas em temperatura constante de 96 graus C.

2.2 Extrações óleo essencial Limão Tahiti

Realizaram-se duas extrações com 56 gramas de casca de limão Tahiti picada em um diâmetro de 4 mm, com 200 ml de água destilada para hidrodestilação em aparelho de Clevenger (destilação por arraste a valor) com duração de três horas em temperatura de 96 graus C.

2.3 Extração por solventes

Os extratos obtidos foram submetidos à separação com diclorometano e hexano, utilizando-se 5 ml de solvente para cada 100 ml de solução óleo/água em funil de separação. As soluções obtidas foram então armazenadas em béqueres e deixadas em repouso durante 24 horas para a total volatilização dos solventes orgânicos, obtendo-se assim, apenas o óleo essencial requerido.

2.4 Avaliação de atividade antibacteriana

Para a avaliação do efeito antibacteriano das frações obtidas nas extrações de óleo essencial, foram utilizadas espécies bacterianas de referência: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990). Os microrganismos foram semeados em placas de Petri estéril com ágar Mueller-Hinton KASVI ®.

Foram utilizados para verificação de desenvolvimento de halos de inibição discos de papel filtro estéreis embebidos em 10 μL de óleo essencial de cada fração obtida na extração por solvente. Para controle, foram utilizados, discos de antibióticos de Amicacina, Clindamicina e Vancomicina DME ®. As placas foram armazenadas em estufa a 37 graus C durante 48 horas. Os halos de inibição foram então medidos para análise preliminar da atividade antimicrobiana. Todos os testes foram realizados em triplicata.

2.5 Avaliação de atividade antifúngica

Para a avaliação do efeito antibacteriano das frações obtidas nas extrações de óleo essencial, foi utilizada a espécie fúngica Candida albicans (ATCC 289065), semeada em placas de Petri estéril com ágar Sabouraud KASVI®.

Foram utilizados para verificação de desenvolvimento de halos de inibição discos de papel filtro estéreis embebidos em 10 μL de óleo essencial de cada fração obtida na extração por solvente. Para controle, foram utilizados discos de papel filtro estéreis embebidos em Nistatina creme 25.000 UI/g (NEO QUÍMICA®), As placas foram armazenadas a temperatura de 25 graus C durante 96 horas. Os halos de inibição foram então medidos para análise preliminar da atividade antimicrobiana. Todos os testes foram realizados em triplicata.

3. Resultado e Discussão

3.1 Avaliações de atividade antibacteriana

3.1.1 Avaliação atividade antibacteriana Laranja Pera (Citrus sinesis)

A tabela 1 mostra o resultado da média do diâmetro dos halos de inibição obtidos nas avaliações da atividade antibacteriana do óleo essencial da Laranja Pera nas extrações com o solvente diclorometano e hexano. Pode-se observar que não houve presença de halos de inibição para as frações testadas do óleo essencial. No entanto, isso não impede que novas pesquisas sejam realizadas a respeito do potencial do efeito antibacteriano frente a S. aureus e S. epidermidis, testando outros métodos de extração.

Os antibióticos Clindamicina, Vancomicina e Amicacina foram utilizados como controle positivo neste teste. A Amicacina apresentou o melhor resultado para os dois microrganismos, sendo que para S. aureus a média dos halos foi de 25,4 mm e para S. epidermidis a média foi 32,1 mm.

Tabela 01. Média do diâmetro dos halos de inibição das frações de óleo essencial de Laranja Pera e dos controles para Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis.

Antimicrobiano/ Fração Valor médio do halo de inibição (mm)

S. aureus

Valor médio do halo de inibição (mm)

S. epidermidis

Clindamicina 17,4 27,8
Vancomicina 15,6 19,3
Amicacina 25,4 32,1
Fração diclorometano 0 0
Fração hexano 0 0

 

3.1.2 Avaliação atividade antibacteriana Limão Tahiti (Citrus aurantifolia)

Estão expressos na tabela 2 os valores da média do diâmetro dos halos de inibição obtidos nas avaliações da atividade antibacteriana do óleo essencial de Limão Thaiti nas extrações com os solventes diclorometano e hexano. É possível observar que houve desenvolvimento de halos de inibição para todos os microrganismos testados com a fração diclorometano. Levando-se em consideração a fração hexânica, houve desenvolvimento de halos de inibição para S. epidermidis e P. aeruginosa

 Tabela 2. Média do diâmetro dos halos de inibição das frações de óleo essencial de Limão Thaiti e dos controles para Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Pseudomonas aeruginosa

Antimicrobiano/ Fração Valor médio do halo de inibição (mm)

S. aureus

Valor médio do halo de inibição (mm)

S. epidermidis

Valor médio do halo de inibição (mm)

P. aeruginosa

Amicacina 25,45 28,5 37
Vancomicina 0 0 19
Clindamicina 23,15 23,15 22,6
Fração diclorometano 7,3 12,3 14
Fração hexano 0 12,6 10,3

 

O Limão Tahiti (Citrus aurantifolia) apresenta 70% de d-limoneno em sua casca, de onde é extraído o óleo essencial (JUNIOR et al, 2007). Segundo Oliveira (2013) d-limoneno, tem extensa aplicação industrial, na área cosmética como fragrância e na área alimentícia como agente antimicrobiano que pôde ser observado neste estudo.

O resultado obtido nas placas com os microrganismos P. aeruginosa e S. epidermidis mostrou-se significativo, com diâmetro dos halos acima de 10 mm mostrando alguma sensibilidade dos microrganismos em relação ao óleo essencial. Tais resultados se mostraram semelhantes aos demonstrados por Soares (2008), que relatou desenvolvimento de halos de inibição de 14 mm.

Subramenium et al., (2014) exploraram a eficácia do d-limoneno como potencial de antibiótico contra espécies do gênero Streptococcus e concluíram que o Limoneno possui cerca de 75-95% de atividade antibiótica contra os agentes patogênicos testados.

Gerhardt et al., (2012) realizaram a avaliação da atividade antibacteriana de extratos alcoólicos da casca das frutas cítricas bergamota-ponkan, pomelo e limão-bergamota, quanto a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e a Concentração Bactericida Mínima (CBM). Neste estudo, o extrato de limão-bergamota apresentou o melhor resultado e a bactéria mais sensível aos extratos foi P. aeruginosa.

3.2 Avaliações de atividade antifúngica

3.2.1 Avaliação atividade antifúngica Laranja Pera (Citrus sinesis)

Na tabela 3 podem-se observar os valores médios de diâmetro dos halos de inibição obtidos nas avaliações da atividade antifúngica do óleo essencial de Laranja Pera nas extrações com o solvente diclorometano e com o solvente hexano. Pode-se observar sensibilidade relevante do fungo frente à fração diclorometano.

Tabela 3. Média do diâmetro dos halos de inibição das frações de óleo essencial de Laranja Pera e do controle para C. albicans.

Antimicrobiano/ Fração Valor médio do halo de inibição (mm)

C. albicans

Nistatina 13
Fração Diclorometano 17
Fração Hexano 0

 

A extração com diclorometano exibiu o melhor resultado, onde o diâmetro do halo foi 17 mm. Oliveira et al., (2007) mostraram uma comparação da atividade antioxidante e antifúngica dos frutos limão, laranja, maçã, berinjela, batata, grãos de arroz e de trigo sobre o fungo Aspergillus flavus. Entre todos os frutos, a laranja expôs 80% e o limão 95% de atividade antifúngica, apresentando os maiores porcentuais de inibição.

Resultados semelhantes foram obtidos por Cavalcanti et al., (2012) no qual realizaram uma pesquisa da atividade antifúngica de óleos essenciais de laranja, limão siciliano, tangerina, pindaíba e guabiroba sobre cepas de C. albicans (ATCC 289065), C. tropicalis (ATCC 40042), C. krusei (ATCC 40147) da cavidade oral, que leva ao desenvolvimento da candidíase bucal. Nesta pesquisa, a laranja pera apresentou halo de 14,5 mm para C. albicans, 16,5 mm para C. tropicalis e 40,0 mm para C. krusei.

Segundo Martos et al., (2007) em seu estudo sobre o efeito dos óleos essenciais de Limão, Tangerina, Toranja e Laranja sobre A. niger, A. flavus, P. chrysogenum e P. verrucosum, o óleo essencial da Laranja foi o mais eficaz contra A. niger.

3.2.2 Avaliação da atividade antifúngica Limão Tahiti (Citrus aurantifolia)

Na tabela 4 podem-se observar os valores médios de diâmetro dos halos de inibição obtidos nas avaliações da atividade antifúngica do óleo essencial de limão Thaiti nas extrações com o solvente diclorometano e hexano. Pode-se observar alguma sensibilidade do fungo frente à fração diclorometano.

Tabela 4. Média do diâmetro dos halos de inibição das frações de óleo essencial de Limão Thaiti e do controle para C. albicans.

Antimicrobiano/ Fração Valor médio do halo de inibição (mm)

C. albicans

Nistatina 13,5
Fração Diclorometano 8,3
Fração Hexano 0

 

Segundo Bhagavani et al., (1992), 60% dos óleos essenciais possuem atividades antifúngicas e 35% exibem atividade antibacteriana. A candidíase tem sido uma infecção muito comum e a Candida albicans é considerada um dos principais agentes causadores desta (LIMA et al, 2006).

Foi possível observar a presença de halos de inibição em diâmetros significativos na extração com diclorometano, apresentando o resultado da média do halo de inibição em 8,3 mm. Lima et al., (2006) mostraram um resultado equivalente, em que o óleo essencial do limão (C. limon) inibiu 42% das cepas de diferentes espécies de Candida que foram utilizadas, com halos de inibição acima de 10 mm.

Araújo et al., (2005) apresentaram o efeito antifúngico in vitro do extrato das cascas do Limão sobre C. albicans, C. tropicalis, C. stellatoidea e C. krusei, o extrato do limão apresentou atividade antifúngica sobre C. albicans, C. tropicalis e C. krusei com halos de inibição de 11 mm a 18 mm.

Conclusão

Os resultados obtidos mostram que:

O óleo essencial de laranja pera não apresentou atividade antibacteriana frente aos microrganismos S. aureus e S. epidermidis.

O óleo essencial de Limão Tahiti apresentou atividade antibacteriana frente às cepas de S. aureus, S.epidermidis e P. aeruginosa, sendo que a extração com diclorometano exibiu halos com diâmetro maior comparado a extração com hexano.

Na avaliação da atividade antifúngica, os óleos essenciais de limão Tahiti e Laranja Pera apresentaram atividade nas extrações com diclorometano com destaque para o óleo essencial da Laranja Pera apresentando maior potencial inibidor.

São necessárias mais pesquisas na tentativa de analisar a atividade antimicrobiana dos óleos utilizados, considerando outras variáveis como: diferentes solventes, técnicas de extração, microrganismos, toxicidade, bem como utilização de métodos para análise de rendimento, isolamento e purificação de princípios ativos, visando à aplicabilidade dos componentes em tratamentos de infecções.

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[1] Acadêmica do Curso Superior em Biotecnologia da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR).

[2] Farmacêutica Profa. Doutoranda da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR).

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