ORIGINAL-ARTIKEL
CASALOTI, Laís Guadalupe [1], SANTOS, Jorge Alexandre Nogueira [2]
CASALOTI, Laís Guadalupe. SANTOS, Jorge Alexandre Nogueira. Hemmung der Elastase durch wässrigen und ethanolischen Blattextrakt von Sedum Dendroideum: Eine In-vitro-Studie. Revista Científica Multidisciplinar Núcleo do Conhecimento. 04 – Jahr, Ed. 07, Vol. 04, S. 140-147. Juli 2019. ISSN: 2448-0959
ZUSAMMENFASSUNG
Die unregulierte Aktivität von Proteasen beim Menschen hängt mit einer Reihe von Krankheiten zusammen. Neutrophile Elastase ist eine Protease, die von dem AAT-Inhibitor (AAT) kontrolliert wird, der natürlicherweise von der Leber produziert wird. Mutationen im SERPINA 1-Gen verursachen einen Mangel an diesem Inhibitor und die Folge davon ist die Entstehung mehrerer Pathologien beim Menschen. Da Pflanzenarten vielversprechende Quellen für die Entdeckung neuer Medikamente sind, zielte die vorliegende Studie darauf ab, die hemmende Wirkung der Extrakte auf die Elastase zu bewerten, wobei IC50-Werte von IC50 8.1 ± 1.4 µg/ml (wässriger Extrakt) und 3.3 ± 0.6 µg/ml (Ethanolextrakt). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Extrakte von Sedum Dendroideum eine potenzielle Quelle von bioaktiven Verbindungen für die Entdeckung neuer Inhibitoren für Elastase sein können.
Stichworte: Balsam, IC50, hibitoren.
EINFÜHRUNG
Proteasen sind essentielle Enzyme für eine Vielzahl physiologischer Prozesse wie Proteinverdauung, Fortpflanzung, Blutgerinnung, Kallikrein-Kinin-System und Fibrinolyse (Otén & Bonde, 2008). Beim Menschen ist die unregulierte Aktivität von Proteasen mit verschiedenen pathologischen Erkrankungen wie Krebs, entzündlichen Prozessen, Thrombose, Arthritis, Hauterkrankungen und Lungenemphysem verbunden. Aus diesem Grund muss die Proteasenaktivität kontrolliert und reguliert werden (Rawlings et al., 2004). Jüngste Untersuchungen haben gezeigt, dass Proteasen zu wichtigen Zielen für die Arzneimittelentwicklung geworden sind. Elastase ist eine Protease, die hauptsächlich von der Bauchspeicheldrüse und Neutrophilen produziert wird, und sie hat die Eigenschaft, Komponenten der extrazellulären Matrix, wie Kollagen, Elastin, Laminin und Proteoglylians, zu hydrolysieren (Thomson & Kapadia, 1979). Die proteolytische Aktivität der neutrophilen Elastase wird streng reguliert durch den endogenen Proteininhibitor namens -1-Antitrypsin (AAT). Mutationen im SERPINA 1-Gen Locus Pi, das sich auf Chromosom 14 (14q31-32) befindet, verursachen Einen AAT-Mangel (Siedle, et al., 2003). Ohne die Anwesenheit seines natürlichen Inhibitors erzeugt die Elastase in Hülle und Fülle Gewebeläsionen, da dieses Enzym die Hauptprotease ist, die von Neutrophilen in entzündlichen Prozessen freigesetzt wird.
Die Wirkung von Elastase hängt mit einer Reihe von Krankheiten wie Leberversagen, rheumatoide Arthritis, Psoriasis, Hautkrebs, Arteriosklerose und mehrere Lungenerkrankungen zusammen (Johansson, 2002). In einer normalen Lunge sind die Alveolen niedrigen Konzentrationen von neutrophiler Elastase ausgesetzt. Diese Protease kann das Elastin in der Alveolarwand zerstören, wenn es nicht durch die Wirkung des Antitrypsin-Inhibitors enthalten ist. Nach einer Verletzung kann sich das Lungengewebe nicht regenerieren und ein Prozess von Emphysem, Asthma, akuter Lungenverletzung oder Mukoviszidose kann ausgelöst werden (Abboud & Vimalanathan, 2008).
Die Prospektion bioaktiver Verbindungen aus natürlichen Produkten findet in den Pflanzenarten die wichtigste und vielversprechendste Quelle neuer Verbindungen, die als Proteasehemmer wirken können. Zum Schutz vor pflanzenfressenden Tieren und Insekten produzieren Pflanzen in der Regel sekundäre Metaboliten, die Terpene, Polyphenole, Tannine, Peptide und Proteine enthalten (Ibanez et al., 2012). Viele dieser Metaboliten sind Inhibitoren von Proteasen und verursachen eine Abnahme des Absorptionsprozesses von essentiellen Aminosäuren für die Entwicklung von Insekten (Cuccilioni et al., 2009).
Die Art Sedum Dendroideum, im Volksmund Balsam genannt, ist eine Pflanze, die zur Ordnung Saxifrales, Moc gehört. Et Sessé ex DC ist eine Vogelart aus der Familie der Tropen, Sukkulenten, Sublenhosa- und Xerophytenarten , die aus Südafrika stammen und aus dem trockenen tropischen Klima stammen (Epagri, 1998). In Brasilien ist es weithin angepasst und wird im Volksmund Balsam (Milaneze & Gonalves, 2001) genannt. Der Saft seiner Blätter wurde zur Behandlung von Hautverzinkung und Blutergüssen und intern für Magenstörungen aufgrund von Weichmachern und Heilaktivitäten verwendet (Epagri, 1998; Milaneze & Gonalvez, 2001).
Studien zeigen, dass die Gattung Sedum Verbindungen verschiedener chemischer Gruppen wie Polysaccharide (Sendl et al.,1993), Tannine (Stevens et al., 1995), Triterpenoide mit hepatoprotektive Aktivität (Aimin, et al.,1998), piperidinische Alkaloide (Halin et al., 1985) und Pyrrolidyic (Harth et al., 1996). Und durch eine phytochemische Analyse mit der Spezies Sedum dendroideum konnte das Vorhandensein von Kaempferol, einem wichtigen Molekül mit pharmakologischen Eigenschaften, identifiziert werden (Coutinho, Muzitano & Costa, 2009). Unter Berücksichtigung des Vorhandenseins von sekundären Metaboliten, die bei der Art gefunden wurden, und in Anbetracht ihrer möglichen Verwendung als Heilpflanze zielte die vorliegende Studie darauf ab, zu überprüfen, ob die wässrigen und ethanolischen Extrakte der Pflanze Hemmung der proteolytischen Aktivität des Elastase-Enzyms.
MATERIALIEN UND METHODEN
Die Extrakte wurden aus den Blättern von Sedum Dendroideum nach der Methodik von Heidari-Sureshjani (2015) hergestellt, in denen frische und gesunde Blätter des Gemüses in der Nachbarschaft Furnas gesammelt wurden (Breitengrad 22° 26′ 27″ und Längengrad 46° 21′ 03″), Gemeinde Bueno Brandéo.
Etwa 10 g der Blätter der Pflanze wurden 72 Stunden lang in einem Gewächshaus bei 40°C getrocknet und anschließend gemahlen, bis sie ein gleichmäßig aussehendes Pulver erhielten. Anschließend wurde das erhaltene Material in eine Glasdurchstechflasche überführt und mit 50 ml destilliertem Wasser vermischt, wobei es 12 Stunden ruhen blieb. Nach diesem Eingriff wurde das Gemisch auf dem Whatman-Papier Nr. 1 gefiltert und eine klare, partikelfreie Flüssigkeit gewonnen. Das gleiche Verfahren wurde für die Herstellung von Ethanol-Extrakt verwendet, jedoch an der Stelle des destillierten Wassers wurde Ethanol 95% verwendet.
Für die Inhibitionstests wurden das Enzym Elastase der Schweinebauchspeicheld (E.C 3.4.21.36, ≥4 U/mg) und sein chromogenes Substrat N-Succinyl-AlaAla-P-Nitroanilid (Thomson & Kapadia, 1979) verwendet, das von der Firma Sigma Aldrich erworben wurde. Das Enzym (bei der Endkonzentration von 10 µg/ml) wurde in Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH = 8) mit den Pflanzenextrakten in unterschiedlichen Konzentrationen (Bereich von 1 bis 20 µg/ml für wässrige Extrakte und Variation von 1 bis 8 µg/ml für Ethanolextrakt) bei 25°C für Ein Gesamtendvolumen von 990 l. Nach 30 Minuten wurde dem Gemisch 10 l Substrat für eine Endkonzentration von 10 m zugesetzt und die Hydrolyse des chromogenen Substrats 5 Minuten lang mit einem Spektralphotometer V-M5 Bel Photonics bei einer Wellenlänge von 410 nm überwacht. Als Negativkontrolle wurden Phosphatpuffer 50 mM, pH 8 und als Positivkontrolle Epigalocatequina-3-Galate verwendet.
Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, und die Daten wurden als mittelmäßige Standardabweichung dargestellt. Die Werte des Hemmungsparameters IC50, d. h. die Konzentration des Extrakts, der 50 % der enzymatischen Aktivität hemmt, wurden durch den Prozentsatz der verbleibenden Hemmung im Vergleich zur Extraktkonzentration bestimmt und durch nichtlineare Regression mit GraFit 5.0 Program (Leatherbarrow, 1992). Der Prozentsatz der Hemmung wurde durch die Gleichung berechnet:
% Hemmung = | ABS-Steuerung – Abs-Extrakt | /Abs-Steuerung x 100%
ERGEBNISSE DISKUSSIONEN
Die Abbildungen 1 und 2 zeigen den Prozentsatz der Hemmung aufgrund unterschiedlicher Konzentrationen von wässrigen und alkoholischen Extrakten. Diese Extrakte hemmten Dieelase mit unterschiedlichen Intensitäten. Wie in Schaubild 1 dargestellt, wurde die höchste Hemmung (59%) in der Konzentration von 20 des Enzyms.
Schaubild 1: Prozentsatz (%) Hemmung der Elastase in Abhängigkeit von verschiedenen Konzentrationen wässriger Extrakte.
In Schaubild 2 können wir beobachten, dass die höchste Hemmung (88%) Die Konzentration lag bei 8 µg/ml.
Schaubild 2: Prozentsatz (%) Hemmung der Elastase in Abhängigkeit von der Konzentration von Ethanolextrakten.
Aus den Ergebnissen der Graphen 1 und 2 wurden die Werte von IC50 (Tabelle 1) für die beiden Extrakte berechnet, 8.1 ± 1.4 µg/ml (wässriger Extrakt) und 3.31 ± 0.6 µg/ml (Ethanolextrakt). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Ethanolextrakt eine bessere Hemmkraft über die Elastase als der wässrige Extrakt zeigte.
Tabelle 1: IC50-Werte von wässrigen und ethanolischen Extrakten auf Elastase. Werte, ausgedrückt als Mittelwert – Standardabweichung.
| IC 50 (µg/ml) | |
| Elastase | |
| Wässriger Extrakt | 8.1 ± 1.4 |
| Ethanolischer Extrakt | 3.3 ± 0.6 |
Quelle: Autor
Pflanzenextrakte bieten unbegrenzte Möglichkeiten, neue Enzyminhibitoren zu entdecken, da sie eine Vielzahl von sekundären Metaboliten produzieren. Diese chemischen Verbindungen werden von Pflanzen verwendet, um sich gegen die Wirkung von pflanzenfressenden Tieren und Insekten zu schützen, und viele dieser Verbindungen sind Inhibitoren mehrerer Klassen von Proteasen, einschließlich Elastase (Sin & Kim, 2005; Middleton et al., 2000).
Wie bereits beschrieben, produziert die Art Sedum Dendroideum eine Vielzahl von sekundären Metaboliten und diese Verbindungen können an der Hemmung der Elastase beteiligt sein.
Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigten, dass die wässrigen und ethanolischen Extrakte von Sedum Dendroideum eine signifikante hemmende Aktivität auf die proteolytische Aktivität der Elastase hatten. Spezifischere Studien sind erforderlich, um bioaktive Verbindungen in den Extrakten von Sedum dendroideum zu identifizieren und zu isolieren.
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[1] Student der Biologischen Wissenschaften am IFSULDEMINAS-Campus Inconfidentes.
[2] PhD in Biochemie von UNIFESP; Effektiver Professor am IFSULDEMINAS-Campus Inconfidentes und Mitarbeiter des Biochemielabors des Environmental Procedures Center.
Eingereicht: Mai 2019.
Genehmigt: Juli 2019.
